Imagerie longitudinale in vivo de cellules rétiniennes avec des sérotypes viraux adéno-associés adaptés par ophtalmoscopie laser à balayage confocal

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de vecteurs de virus adéno-associés (AAV) pour le marquage spécifique des cellules et l’imagerie in vivo à l’aide d’un ophtalmoscope laser à balayage confocal (CSLO). Cette méthode permet d’étudier différents types de cellules rétiniennes et leurs contributions à la fonction et à la maladie rétiniennes.

Résumé

La nature dynamique des processus cellulaires rétiniens nécessite des progrès dans l’administration de gènes et les techniques de surveillance en direct pour améliorer la compréhension et le traitement des maladies oculaires. Cette étude introduit une approche optimisée de virus adéno-associé (AAV), en utilisant des sérotypes et des promoteurs spécifiques pour obtenir une efficacité de transfection optimale dans les cellules rétiniennes ciblées, y compris les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) et la glie de Müller. Tirant parti de la précision de l’ophtalmoscopie laser à balayage confocal (CSLO), ce travail présente une méthode non invasive d’imagerie in vivo qui capture l’expression longitudinale de la protéine fluorescente verte (GFP) médiée par AAV. Cette approche élimine le besoin de procédures terminales, préservant la continuité de l’observation et le bien-être du sujet. De plus, le signal GFP peut être retracé dans les CGR infectés par l’AAV le long de la voie visuelle vers le colliculus supérieur (SC) et le noyau géniculé latéral (LGN), ce qui permet une cartographie directe de la voie visuelle. Ces résultats fournissent un protocole détaillé et démontrent l’application de cet outil puissant pour des études en temps réel du comportement des cellules rétiniennes, de la pathogenèse de la maladie et de l’efficacité des interventions de thérapie génique, offrant des informations précieuses sur la rétine vivante et ses connexions.

Introduction

Étant la seule partie du système nerveux central accessible optiquement, la rétine sert de modèle précieux pour la recherche en neurosciences¹. Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR), les neurones de sortie de la rétine qui transmettent des informations visuelles au cerveau, jouent un rôle crucial dans la fonction visuelle. Leur perte ou leur dysfonctionnement entraîne une déficience visuelle et une cécité irréversible, comme on le voit dans le glaucome et d’autres neuropathies optiques². Les cellules gliales de Müller, les principales cellules gliales de la rétine, sont essentielles au maintien de l’homéostasie rétinienne, à la fourniture d’un soutien structurel et métabolique aux neurones, à la régulation des niveaux de neurotransmetteurs et à la contribution à la réparation et à la régénération de la rétine³. Leur dysfonctionnement est impliqué dans diverses maladies rétiniennes, notamment la rétinopathie diabétique⁴, la dégénérescence maculaire liée à l’âge⁵ et le syndrome ischémique oculaire⁶. Les RGC et la glie de Müller présentent des interactions étroites et une interdépendance ; Les cellules gliales de Müller fournissent un soutien essentiel aux CGR, tandis que l’activité des cellules gliales de Müller peut influencer la fonction^{gliale de} Müller ^3,7. L’étude des CGR et de la glie de Müller est cruciale pour comprendre la fonction rétinienne et développer des traitements efficaces pour de multiples maladies rétiniennes.

Les évaluations actuelles de la recherche rétinienne utilisent principalement des techniques telles que la tomographie par cohérence optique (OCT) pour mesurer l’épaisseur de la couche de fibres nerveuses rétiniennes ou les trajectoires des faisceaux axonaux ^8,9. Bien que ces méthodes soient inestimables pour détecter la perte de CGR, elles ne fournissent pas une vue détaillée de la morphologie du CGR et des cellules gliales en raison de leur résolution limitée. De même, bien que des techniques avancées telles que l’ophtalmoscopie laser à balayage d’optique adaptative (AO-SLO) permettent l’imagerie au niveau cellulaire des CGR, des photorécepteurs et des cellules gliales dans la rétine humaine vivante¹⁰, leur complexité technique et leur accessibilité limitée limitent leur utilisation principalement à des contextes de recherche spécialisés. Compte tenu de ces contraintes, il est nécessaire de développer des méthodes plus accessibles et plus fiables pour l’étude approfondie de populations spécifiques de cellules rétiniennes in vivo.

En conséquence, ce protocole vise à introduire une approche d’imagerie alternative adaptée aux applications de recherche dans les cellules rétiniennes. Il combine la puissance du marquage spécifique au type de cellule médié par AAV avec la nature non invasive de l’imagerie CSLO. Les virus adéno-associés (AAV) sont des vecteurs de libération de gènes polyvalents connus pour leur faible immunogénicité et leur capacité à transduire un large éventail de types de cellules, y compris les cellules en division et non divisées¹¹. Cela en fait des outils idéaux pour cibler des populations cellulaires spécifiques dans l’environnement rétinien complexe. En utilisant des vecteurs AAV avec des sérotypes et des promoteurs soigneusement sélectionnés, l’expression sélective de protéines fluorescentes peut être obtenue dans plusieurs types de cellules d’intérêt, tels que les RGC et les glies de Müller. Par exemple, l’AAV2 est connu pour son efficacité de transduction plus élevée dans les RGC^12,13, tandis que l’AAV8 est nettement efficace pour cibler les photorécepteurs¹⁴, et l’AAV9 démontre de fortes capacités de transfection dans la glie de Müller¹⁵, montrant une large efficacité sur diverses couches de cellules rétiniennes. Il est important de noter que l’efficacité de l’AAV dépend non seulement du choix du sérotype, mais aussi des promoteurs, qui dictent l’intensité et la spécificité cellulaire de l’expression du transgène, soulignant l’importance d’une sélection minutieuse pour obtenir une transduction optimale.

Pour le marquage RGC, ce protocole utilise AAV2 avec le promoteur de la synapsine humaine (hSyn). AAV2 présente une transduction efficace des CGR après une injection intravitréenne¹³, et le promoteur hSyn, un promoteur neuronal omniprésent, entraîne l’expression de transgènes forts et spécifiques dans ces cellules¹⁶. Pour la glie de Müller, le protocole utilise des vecteurs AAV9 pilotés par le promoteur GfaABC1D¹⁷, qui démontre une forte expression transgénique dans ces cellules¹⁵. Cette approche de marquage ciblée permet aux chercheurs de distinguer ces cellules du tissu rétinien environnant et de les suivre au fil du temps, fournissant ainsi une base pour la surveillance in vivo des cellules rétiniennes et de leurs réponses aux changements bioenvironnementaux.

L’ophtalmoscopie laser à balayage confocal (CSLO) est une technique d’imagerie non invasive qui fournit des images haute résolution de la rétine vivante, permettant la visualisation en temps réel des populations de cellules rétiniennes marquées par fluorescence 18,19,20. Un faisceau laser focalisé balaie la rétine, capturant la lumière émise qui passe à travers un sténopé pour éliminer les signaux flous, ce qui permet d’obtenir des images plus nettes avec un contraste amélioré. Ce protocole utilise un système CSLO Heidelberg Spectralis, qui a été largement utilisé pour l’imagerie des cellules rétiniennes chez les animaux vivants, y compris des études visualisant les RGCs^21,22 et la microglie²³ marqués transgéniques. En utilisant l’unité HRA CSLO avec un laser de 488 nm et des filtres appropriés, les chercheurs peuvent imager des RGC ou des glies de Müller marqués par fluorescence chez des animaux vivants après une injection intravitréenne de vecteurs AAV porteurs de gènes rapporteurs fluorescents. Le protocole d’imagerie longitudinale, avec des séances hebdomadaires couvrant à la fois la rétine centrale et périphérique, suit les changements au fil du temps. Pour donner la priorité au bien-être animal, le protocole utilise le système de suivi oculaire automatique (ART) de l’unité CSLO de la HRA, permettant une acquisition d’images précise sans avoir besoin d’anesthésie générale ou de lentilles de contact.

Ce protocole exploite la puissance combinée de l’AAV et du CSLO pour permettre la surveillance longitudinale de types spécifiques de cellules rétiniennes in vivo. En associant la spécificité du type cellulaire du marquage médié par AAV aux capacités d’imagerie non invasives et à haute résolution de CSLO, cette méthode permet aux chercheurs d’étudier les changements dynamiques dans les RGC et la glie de Müller en réponse à divers stimuli ou interventions. Ces connaissances recèlent un potentiel important pour éclairer l’élaboration de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques pour les maladies de la rétine.

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Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Capital Medical University, à Pékin. Des souris C57BL/6J mâles adultes de quatre semaines (pesant entre 15 et 20 g) ont été utilisées pour toutes les expériences et logées dans des pièces à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12/12 h. De la nourriture et de l’eau standard pour rongeurs étaient disponibles à volonté. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Transfection de cellules rétiniennes médiée par AAV

REMARQUE : Pour la transduction ciblée des CGR, ce protocole utilise AAV2-hSyn-eGFP, qui intègre le promoteur hSyn pour favoriser l’expression robuste de la GFP améliorée. La glie de Müller est ciblée à l’aide d’AAV9-GfaABC1D-eGFP. Pour obtenir une efficacité de transduction optimale et une expression robuste des transgènes, un titre AAV minimum de 1 x 10¹² génomes viraux (vg)/mL est recommandé pour les injections intravitréennes chez la souris¹³.

1. Respectez des protocoles de sécurité stricts lors de la réalisation de procédures de transfection de cellules rétiniennes médiées par AAV afin de prévenir l’exposition accidentelle et d’assurer un environnement de travail sûr.
2. Effectuer toutes les procédures impliquant des vecteurs viraux dans une enceinte de biosécurité (ESB) certifiée. Équipez le personnel d’un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des blouses de laboratoire, des gants et des lunettes de protection, pendant toute la durée de l’intervention.
3. Éliminer correctement tous les objets tranchants et les matières à risque biologique conformément aux protocoles de sécurité de l’établissement afin de maintenir la conformité et de protéger tout le personnel du laboratoire.

2. Préparation des vecteurs viraux et des animaux

1. Obtenez les vecteurs AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP stockés à -80 °C. Décongeler les vecteurs sur de la glace immédiatement avant de les utiliser afin de préserver l’intégrité virale.
2. Anesthésier les souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à une dose de 50 mg/kg. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en testant les réflexes arrière du pied avant d’autres actions.
3. Coupez les moustaches pour éviter d’interférer avec la zone chirurgicale pendant la procédure. Désinfectez l’orbite avec une solution de povidone iodée à 20 % pendant 2 s, puis rincez abondamment avec une solution saline normale stérile.
4. Appliquez localement une goutte de proparacaïne à 0,5 % pour minimiser l’inconfort et prévenir les mouvements oculaires involontaires.

3. Manipulation et injection intravitréenne de vecteurs viraux

1. Transférez 1 μL de la solution AAV sélectionnée (soit AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP) dans un morceau de film de paraffine propre et pré-refroidi pour éviter les fluctuations de température qui pourraient affecter l’activité virale.
2. Aspirer la solution AAV à l’aide d’une seringue en verre Hamilton avec une aiguille biseautée de 33 G sous le microscope chirurgical ophtalmique.
3. Placez la souris en position couchée ventrale sous le microscope. Inclinez légèrement la tête pour élever le côté oculaire destiné à l’injection. Ajustez et optimisez le grossissement du microscope pour identifier clairement la région supérieure de l’orbite de la souris.
4. Insérez l’aiguille de 1 à 2 mm en arrière du limbe au niveau du bord scléral supérieur de l’œil dans la cavité vitrée. Injectez lentement les solutions AAV pour éviter les refoulements ou les dommages induits par la pression.
   REMARQUE : Emplacement du site d’injection : Effectuez l’injection dans le quadrant temporal supérieur de l’œil, à environ 1 mm en arrière du limbe. Choisissez cet emplacement pour éviter les vaisseaux sanguins majeurs et minimiser le risque d’endommager le cristallin. Évitez les sites d’injection trop proches du limbe pour éviter la pénétration de l’iris ou l’abrasion du cristallin. Éviter la vascularisation : Utilisez un microscope opératoire pour examiner soigneusement le site d’injection prévu pour les vaisseaux sanguins visibles avant l’injection. S’il y a des navires, ajustez légèrement le point d’entrée pour les éviter. Insérez l’aiguille à un angle peu profond, parallèle à l’iris, pour réduire davantage le risque de lésions vasculaires. Évitez les injections répétées dans la même zone pour réduire le risque d’hémorragie sous-rétinienne.
5. Maintenez l’aiguille en place pendant 30 secondes pour permettre aux vecteurs de se disperser dans la chambre vitrée et de se fixer sur la surface rétinienne, maximisant ainsi les chances de réussite de la transduction.
6. Retirez l’aiguille lentement pour minimiser le risque de reflux vitréen.
7. Appliquez une pommade antibiotique topique sur le site d’injection immédiatement après l’injection. Assurez-vous que la pommade est appliquée uniformément pour couvrir entièrement la surface oculaire, évitant ainsi l’infection oculaire et l’inflammation.
   REMARQUE : La pommade antibiotique contient 1 mg / g de dexaméthasone, 3500 UI / g de sulfate de néomycine et 6000 UI / g de sulfate de polymyxine B.
8. Placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle pendant la récupération de l’anesthésie, et surveillez-la de près pour détecter tout signe de détresse ou d’anomalie. Une fois qu’ils sont complètement rétablis et qu’ils ne présentent aucune complication, retournez-les dans leurs cages avec un accès à de la nourriture et à de l’eau normales.

4. Imagerie in vivo avec CSLO

1. Préparation des animaux
   1. Sélectionnez la souris infectée par AAV2-hSyn-eGFP ou AAV9-GfaABC1D-eGFP après 4 semaines d’injection intravitréenne. Appliquer une goutte d’une solution pour les yeux contenant 0,5 % de tropicamide et 0,5 % de phényléphrine à la surface de l’œil pour dilater la pupille à environ 2 mm de diamètre²².
      REMARQUE : Un intervalle de temps de transduction AAV d’au moins 4 semaines est recommandé pour le marquage fluorescent optimal des cellules rétiniennes après l’injection intravitréenne¹³. De plus, dans nos expériences d’écrasement du nerf optique (ONC), les rétines ont été imagées 4 semaines après l’infection, ainsi que les jours 7 et 14 après la blessure par écrasement. Ces points temporels ont été choisis pour capturer à la fois l’expression initiale de l’AAV et la progression des changements rétiniens après ONC.
   2. Couvrez la plate-forme d’imagerie avec un morceau du tampon propre pour éviter la contamination possible des excréments animaux pendant le processus d’opération.
      REMARQUE : La plate-forme d’imagerie sur mesure offre suffisamment d’espace pour que l’animal puisse s’allonger sur le ventre, assurant la stabilité et minimisant les mouvements pendant la contention manuelle pour une acquisition d’image optimale.
   3. Transférez soigneusement la souris sur la plate-forme d’imagerie et prévoyez une période d’acclimatation de 2 à 5 minutes avant l’imagerie afin de minimiser le stress et de faciliter l’adaptation à l’environnement d’imagerie.
   4. Avec l’aide d’un deuxième technicien, immobilisez doucement l’animal tout en maintenant un état conscient tout au long de la procédure. Prévoyez un intervalle de repos de 10 secondes après 15 s d’imagerie pour permettre le clignement des yeux et maintenir l’humidité de la cornée.
      REMARQUE : Frottez doucement la peau du cuir chevelu pour induire un soulèvement spontané des paupières, en évitant l’utilisation d’une contention forcée des paupières ou de dispositifs supplémentaires tels que des clips, réduisant ainsi le risque de blessure aux yeux. L’anesthésie générale n’est pas utilisée pour préserver la clarté optique pendant les séances d’imagerie prolongées, car elle peut exacerber l’opacité transitoire du cristallin. Trouvez un équilibre entre l’acquisition d’images de haute qualité et le confort et la sécurité des animaux tout au long de la procédure. Complétez l’ensemble de la procédure en 5 min pour assurer le bien-être de l’animal et maintenir la qualité de l’imagerie.
   5. Ajustez la posture de la tête et alignez l’objectif de la caméra en ajustant avec précision le bouton de mise au point (Figure 1B) et le micromanipulateur (Figure 1C) pour viser la région d’intérêt (ROI) pour l’imagerie in vivo ultérieure.
2. Configuration du système
   1. Fixez un objectif grand angle de 55° sans contact sur l’appareil photo pour élargir le champ de vision de la zone du fond d’œil.
   2. Réglez la roue à filtres sur la position A (angiographie) pour permettre l’acquisition des modes d’imagerie infrarouge (IR) et fluorescente (FA) (Figure 1A). Allumez le laser et l’alimentation pour activer le système d’imagerie CSLO.
   3. Ouvrez le logiciel Heidelberg Eye Explorer et créez un nouvel examen en cliquant sur l’icône Nouveau patient en haut de la barre de menu. Entrez les informations pertinentes sur l’animal et acceptez la courbure cornéenne par défaut de 7,7 mm dans la fenêtre contextuelle.
   4. Sélectionnez le bouton jaune Démarrer (Figure 1E) sur l’écran du panneau de commande pour lancer le mode d’imagerie en direct.
3. Imagerie CSLO in vivo
   1. Sélectionnez le mode IR (Figure 1G) avec autofluorescence à une longueur d’onde d’excitation de 820 nm sur le panneau de commande. Pour obtenir une imagerie haute résolution, la technologie High Res. Le mode (HR) est activé via l’interface de la fenêtre ou le panneau de commande manuel (Figure 1F).
      REMARQUE : L’imagerie par réflectance infrarouge (IR) est généralement la première étape de l’imagerie ophtalmique CLSO, acquise avant l’angiographie à la fluorescéine (AF), pour fournir une vue de base. Un éclairage uniforme, des artefacts minimaux et une mise au point nette sur les principaux vaisseaux rétiniens sont essentiels pour la fiabilité de la mise au point dans le plan z et l’obtention d’images IR de haute qualité.
   2. Déplacez l’objectif vers l’œil de la souris à l’aide du joystick avec le micromanipulateur XYZ pour un réglage fin. Examinez la transparence optique et tournez le bouton de sensibilité (Figure 1D) dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour réduire la luminosité de l’image du fond d’œil à 40 % à 60 %, évitant ainsi la surexposition du fond d’œil et améliorant la visualisation des détails rétiniens.
   3. Ajustez le bouton de mise au point et le micromanipulateur jusqu’à ce que le disque optique et les vaisseaux rétiniens soient identifiés sans ambiguïté sur le fond d’œil.
      REMARQUE : Critères du plan focal optimal : (1) Vue du fond d’œil uniformément éclairée sans coins sombres. (2) Éclairage en uniforme entourant le disque optique sans taches sombres focales ni distorsion. (3) Forme claire de la lumière des gros vaisseaux rétiniens avec le mouvement visible du flux sanguin.
   4. Passez en mode FA (Figure 1H) avec un laser bleu à semi-conducteurs à une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et un filtre barrière à 500 nm. Tournez le bouton de sensibilité (Figure 1D) dans le sens des aiguilles d’une montre pour augmenter la luminosité de l’image du fond d’œil de 50 % à 107 % afin d’éclairer la zone rétinienne ciblée.
   5. Réglez la valeur moyenne de l’ART (une barre bleue en bas à gauche de l’interface du logiciel) à au moins 15 pour améliorer le rapport signal/bruit. Cette fonction calcule la moyenne d’une série de B-scans acquis au même endroit, ce qui améliore la qualité de l’image.
      REMARQUE : Bien qu’une valeur de moyenne ART plus élevée améliore généralement la qualité de l’image grâce au calcul de la moyenne, elle prolonge également la durée de balayage. Cette durée prolongée pourrait potentiellement augmenter le risque de déshydratation de la cornée et de fatigue chez l’animal, facteurs qui doivent être soigneusement pris en compte, en particulier lors de l’imagerie animale éveillée.
   6. Se réaligner sur le plan interne de la rétine, en ciblant spécifiquement les CGR exprimant la GFP ou les cellules gliales de Müller. Des réglages fins sont effectués pour assurer un éclairage précis de la population cellulaire souhaitée, telle que le soma et les axones RGC, ou le corps cellulaire de Müller. La sensibilité d’imagerie est équilibrée pour obtenir une visualisation optimale et éviter la sursaturation des cellules GFP positives.
      REMARQUE : Pour obtenir des images avec une clarté et une luminosité comparables du signal GFP, l’acquisition de sensibilité doit être constante pour toutes les souris de l’expérience.
   7. Appuyez sur le bouton de sensibilité (Figure 1D) pour lancer le mode ART, qui génère une image moyenne en direct en ligne. Attendez que la barre bleue (représentant la valeur moyenne ART) en bas à gauche de l’interface logicielle ait atteint la valeur ART définie (≥ 20 images) et appuyez sur le bouton Acquérir de l’interface de contrôle pour capturer les images du fond d’œil.
      REMARQUE : Pour le mode ART, le suivi oculaire est intégré pour compenser automatiquement les mouvements oculaires mineurs pendant l’imagerie in vivo , permettant une mise au point cohérente sur le plan focal rétinien sélectionné.
   8. Une fois les images souhaitées obtenues, quittez le mode ART en appuyant sur le bouton de sensibilité de l’écran tactile.
      REMARQUE : Pour éviter le dessèchement de la cornée et permettre le clignement spontané des yeux, des pauses de 10 s ont été mises en place toutes les 15 s pendant le processus d’imagerie.
   9. Pour naviguer dans les zones nasale et temporale de la rétine, déplacez la tête de la caméra horizontalement tout en observant l’image en direct à l’écran. Une fois la région cible atteinte, affinez la mise au point et démarrez le processus d’imagerie comme décrit aux étapes 2.3.1 à 2.3.8.
      REMARQUE : Maintenez des mouvements de caméra lents et contrôlés tout en assurant un éclairage constant et lumineux du fond d’œil. Si des zones sombres apparaissent, utilisez le micromanipulateur pour ajuster la position de la caméra verticalement et recentrer la rétine.
   10. Pour obtenir une image de la rétine supérieure, ajustez doucement la position de la tête de la souris sur le dos. Inclinez modérément la tête de la caméra vers le haut pour l’aligner avec la région rétinienne supérieure. Réajustez la mise au point si nécessaire et procédez à l’imagerie.
   11. Une fois l’imagerie terminée, toutes les régions rétiniennes souhaitées quittent la fenêtre d’acquisition et les images sont automatiquement enregistrées. Appliquez un lubrifiant topique sur l’œil imagé pour maintenir l’hydratation de la cornée.
   12. Pour amorcer l’examen de l’œil controlatéral, repositionnez l’animal du côté opposé de la plate-forme et répétez les étapes 2.3.1 à 2.3.11.

5. Traitement et analyse d’images

1. Exportation et préparation d’images
   1. Ouvrez le logiciel Heidelberg Eye Explorer et sélectionnez la séance d’imagerie CSLO souhaitée de bonne qualité. Choisissez des images uniques ou consécutives du même emplacement rétinien avec des paramètres de sensibilité cohérents dans le temps.
   2. Excluez les images floues avec une mauvaise mise au point ou une mauvaise clarté cornéenne, en veillant à ce que seules les images avec une visualisation claire des structures rétiniennes soient utilisées pour l’analyse. Exportez ces images au format TIFF pour un traitement ultérieur.
2. Alignement et recadrage de l’image
   1. Regroupez les images par œil de souris en fonction de la même région rétinienne.
      REMARQUE : Les images originales acquises à partir du système CSLO sont enregistrées au format suivant : TIFF, avec une dimension de 1536 x 1536 pixels, une résolution de 5,69 um/pixel et une valeur ART de ≥15.
   2. Pour les examens de suivi, importez les images dans un logiciel de traitement d’images approprié. Faites pivoter et alignez les images si nécessaire pour qu’elles correspondent à l’orientation de l’image de base. Lors de l’enregistrement ou de l’exportation des images traitées, utilisez des paramètres qui maintiennent la meilleure qualité d’image possible afin de minimiser les artefacts de compression potentiels.
   3. Alignez les images CSLO à partir d’une série chronologique du même œil en les faisant pivoter pour correspondre à l’image de base respective en utilisant le système vasculaire et le disque optique comme points de repère.
      REMARQUE : Examinez attentivement chaque image alignée et, avant de procéder au recadrage, assurez-vous qu’elles répondent aux critères suivants : (1) Capture complète de la région rétinienne : L’image doit englober entièrement la région rétinienne d’intérêt prévue, y compris les points de repère clés tels que le disque optique et les principaux vaisseaux sanguins ; (2) Absence d’artefacts de mouvement : L’image doit être exempte de flou, de traînée ou de duplication des structures causée par le mouvement oculaire pendant l’imagerie ; (3) Distorsion minimale : L’image doit représenter avec précision la structure rétinienne sans déformation, étirement ou effet de compression qui pourraient résulter des angles d’imagerie ou des effets de lentille. (4) Équilibre des mesures de qualité d’image : Évaluations des niveaux de bruit de fond (écart-type des intensités de pixels dans les zones sans structure < 5 (échelle de 0 à 255)) ; rapport signal/bruit (SNR >20), cohérence de l’éclairage (coefficient de variation entre six quadrants d’image <10 %) et uniformité de l’image (coefficient de variation dans les régions homogènes <15 %).
   4. Sélectionnez l’image pivotée et exportez-la au format TIFF. Pour chaque point temporel, utilisez l’outil de recadrage pour sélectionner et recadrer au hasard 5 à 10 zones (300 x 300 pixels chacune) contenant des cellules GFP positives à partir des images dont la qualité est approuvée. Exportez chaque image recadrée individuellement au format TIFF pour une analyse plus approfondie.
3. Mesure de l’intensité de fluorescence
   1. Ouvrez les images CSLO recadrées (niveaux de gris 8 bits, 300 x 300 pixels) dans ImageJ/Fiji.
   2. Pour examiner les changements globaux des signaux fluorescents, mesurez l’intensité totale de fluorescence par image recadrée à l’aide de l’option Analyser > mesurer (ou Ctrl + M). Enregistrez la valeur « Moyenne », qui représente l’intensité moyenne de fluorescence GFP de l’ensemble de l’image recadrée.
4. Quantification RGC
   1. Dans ImageJ/Fiji, ajustez le seuil d’intensité des images CSLO recadrées à l’aide de l’option Ajuster > luminosité/contraste > pour obtenir une visualisation optimale des corps blancs individuels sur fond noir.
      REMARQUE : Déterminez un seuil individualisé après avoir examiné le lot d’images recadrées, ou appliquez un algorithme de seuillage cohérent (par exemple, la méthode⁵ de Huang dans ImageJ/Fiji). Pour la méthode de Huang : (1) Convertissez les images en niveaux de gris 8 bits (type > image > 8 bits). (2) Accédez à l’outil de seuillage (Image > Ajuster > seuil). (3) Sélectionnez Huang comme méthode de seuillage. (4) Prévisualisez la segmentation et cliquez sur Appliquer. Le seuil sera automatiquement calculé et affiché sur l’histogramme de l’image.
   2. Activez le plugin Cell Counter et cliquez sur chaque soma RGC GFP-positif pour compter. Enregistrez le nombre total de cellules marquées dans la région analysée. Répétez ce processus pour toutes les images recadrées à partir de chaque point de suivi dans le temps.
5. Analyse des données
   1. Exportez les données de numération cellulaire et d’intensité de fluorescence vers un tableur ou un logiciel statistique (par exemple, GraphPad Prism).
   2. Effectuer des tests statistiques appropriés sur la base du plan d’expérience et des hypothèses correspondants. Interprétez les résultats et concluez.

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Résultats

Selon le protocole présenté, différentes cellules rétiniennes ont été visualisées et suivies in vivo à l’aide d’une combinaison d’administration de gènes médiée par AAV et de CSLO. AAV2-hSyn-eGFP a efficacement transduit les CGR, ce qui a entraîné une expression robuste de l’eGFP dans toute la rétine, comme le confirme le CSLO et la colocalisation avec le marqueur spécifique du RGC, la protéine de liaison à l’ARN avec épissage multiple (RBPMS), spéci...

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Discussion

Le protocole présenté détaille une méthode robuste et accessible pour la surveillance in vivo de populations spécifiques de cellules rétiniennes, exploitant la puissance de l’administration de gènes médiée par AAV et de l’imagerie CSLO. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles, facilitant les études longitudinales de la dynamique des cellules rétiniennes et de leurs réponses à une lésion ou à une maladie dans des condi...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 Gauge Needle	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7803-05	For intravitreal injection
0.5% proparacaine	Santen Pharmaceutical Co., Ltd.		Topical Aneasthetics
AAV2-hSyn-eGFP	OBiO Technology Corp., China		Virus titer: 2.7 x 1012 viral genomes (vg)/mL
AAV9-GfaABC1D-eGFP	WZ Biosciences Inc., China		Virus titer: 4.5 x 1012 viral genomes (vg)/mL
Betadine	Healthy medical company	001651	Topical Antiseptics
Corneal scelar forceps (toothed)	Mingren Eye Instruments, China	MR-F301A	For eyelid secure during intravitreal injection
Dumont 05# forceps	FST	51-AGT5385	For optic nerve crush
Graphpad prism	GraphPad Prism, USA		Graph drawing and statistical analysis
HRA Spectralis	Heidelberg Engineering, GmbH, Dossenheim, Germany		"IR" and "FA" mode for CSLO imaging
Image J/Fiji	National Institutes of Health, USA		Image processing
Maxitrol antibiotic ointment	Alcon Laboratories, INC. USA	0065-0631	Topical antibiotics
Microliter Syringe	Hamilton Corp., Reno, NV, USA	7633-01	For intravitreal injection
Mydrin-P Ophthalmic solution	Santen Pharmaceutical Co.,Ltd, Japan		Pupil dilation
Ophthalmic surgical microscope	Leica AG, Heerbrugg, Switzerland	M220	For surgical operations
Pentorbarbitol Sodium	Sigma Aldrich, USA	57-33-0	Genereal Aneasthetics
Powerpoint	Microsoft Corporation, USA		Image alignment and cropping
VISCOTEARS Liquid Gel (Carbomer)	Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm. Fabrik, Germany		Topical lubricant