Standardisation d’un nouveau logiciel semi-automatique pour la mesure de l’excroissance des neurites

Résumé

Les tests de croissance des neurites fournissent une valeur quantitative sur les processus neuronaux régénératifs. L’avantage de ce logiciel semi-automatique est qu’il segmente les corps cellulaires et les neurites séparément en créant un masque et mesure divers paramètres tels que la longueur des neurites, le nombre de points de branchement, la surface des grappes de corps cellulaires et le nombre de grappes de cellules.

Résumé

Des techniques efficaces d’imagerie en direct sont cruciales pour évaluer la morphologie neuronale afin de mesurer la croissance des neurites en temps réel. La mesure correcte de la croissance des neurites a été un défi de longue date au fil des ans dans le domaine de la recherche en neurosciences. Ce paramètre sert de pierre angulaire dans de nombreux montages expérimentaux in vitro , allant des cultures dissociées et des cultures organotypiques aux lignées cellulaires. En quantifiant la longueur des neurites, il est possible de déterminer si un traitement spécifique a fonctionné ou si la régénération axonale est améliorée dans différents groupes expérimentaux. Dans cette étude, l’objectif est de démontrer la robustesse et la précision du logiciel d’analyse de l’excroissance des neurites Incucyte Neurotrack. Ce logiciel semi-automatique est disponible dans un système de microscopie time-lapse qui offre plusieurs avantages par rapport aux méthodologies couramment utilisées dans la quantification de la longueur du neurite dans les images en contraste de phase. L’algorithme masque et quantifie plusieurs paramètres dans chaque image et renvoie des métriques cellulaires neuronales, notamment la longueur des neurites, les points de branchement, les amas de corps cellulaires et les zones d’amas de corps cellulaires. Tout d’abord, nous avons validé la robustesse et la précision du logiciel en corrélant ses valeurs avec celles du manuel NeuronJ, un plug-in fidjien. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé l’algorithme qui est capable de travailler à la fois sur des images en contraste de phase et sur des images d’immunocytochimie. À l’aide de marqueurs neuronaux spécifiques, nous avons validé la faisabilité de l’analyse de la croissance des neurites basée sur la fluorescence sur des neurones sensoriels dans des cultures in vitro . De plus, ce logiciel peut mesurer la longueur des neurites dans diverses conditions d’ensemencement, allant de cellules individuelles à des réseaux neuronaux complexes. En conclusion, le logiciel fournit une plate-forme innovante et rapide pour les tests de croissance des neurites, ouvrant la voie à des quantifications plus rapides et plus fiables.

Introduction

Dans les nerfs sciatiques, il est possible de mesurer la régénération axonale¹. De plus, des études in vitro ont montré la faisabilité de la surveillance de la croissance axonale ^2,3 pour comprendre ses différentes phases, de la germination axonale à la dégénérescence axonale, dans les neurones sains et blessés. En suivant ces processus, il est possible de mesurer des paramètres tels que la polarité axonale, l’initiation, la stabilité et la ramification. Le dernier paramètre est crucial pour comprendre la perception de la douleur

Protocole

1. Balayage du récipient sur la machine

REMARQUE : La détection est effectuée par la caméra Basler Ace 1920-155 μm intégrée.

1. Ouvrez le programme en cliquant sur Se connecter à l’appareil et en sélectionnant Planifier - À acquérir. Cliquez ensuite sur le signe + .
2. Spécifiez si le navire sera scanné à plusieurs reprises ou seulement 1x en choisissant l’option Scanner selon le calendrier ou Scanner une fois maintenant, respectivement.
3. Sélectionnez Nouveau pour cré....

Discussion

Mesurer avec précision la croissance des neurones dans des conditions saines, blessées et malades est un paramètre essentiel dans de nombreuses configurations expérimentales dans le domaine des neurosciences. Qu’il s’agisse de travailler avec des cultures organotypiques d’explants de DRG entiers ou de cultures dissociées, la mesure correcte de l’excroissance axonale a été un défi de taille au cours des 20 dernières années. Sans une quantification fiable et précise de l.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase A	Merck / Roche	10103586001
Dispase II (neutral protease, grade II)	Merck / Roche	4942078001
Dulbecco's modified eagle's medium	Merck / Sigma	D5796
Fetal bovin serum	Merck / Sigma	F7524
Ham's F-12 Nutrient Mix (1X)	ThermoFisher Scientific	21765029
Ham's F12 w/ L-Glutamine	Euroclone	ECM0135L
Hanks' Balanced Salt Solution	Euroclone	ECM0507L
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	ThermoFisher Scientific	14185045
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (U.S.)	Cytiva	SH30071.03
Incucyte, Neurotrack Analysis Software	Sartorius	9600-0010
L-15 Medium (Leibovitz)	Millipore/Sigma	L5520
Laminin Mouse Protein, Natural	ThermoFisher Scientific	23017015
L-Cysteine	Merck / Sigma	C7352
Leibovitz's L-15 medium w/o L-glutamine	Euroclone	ECB0020L
mouse NGF 2.5S (>95%)	Alomone Labs	N-100
Neurobasal Medium [-] Glutamine	ThermoFisher Scientific	21103049
NSC-34	CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)	CLU140
Papain from papaya latex	Sigma	P4762
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15070063
Percoll (Density 1.130 g/mL)	Cytiva	17089101
Poly-D-Lysine Solution (1mg/mL)	EMD Millipore/Merck	A-003-E
Poly-L-Lysine Solution (0-01%)	Sigma	P4832
Recombinant Human NT-3	PeproTech	450-03
Retinoic Acid	Merck / Sigma	R2625
Trypsin-EDTA solution	Sigma	T3924
β-Tubulin III (Tuj1) antibody	Merck / Sigma	T8660