Quantification des phénotypes oculaires de Drosophila melanogaster : une approche computationnelle intégrant ilastik et Flynotyper

Résumé

Le système oculaire de la drosophile est un outil utile pour étudier divers processus biologiques, en particulier les maladies neurodégénératives humaines. Cependant, la quantification manuelle des phénotypes de l’œil rugueux peut être biaisée et peu fiable. Nous décrivons ici une méthode par laquelle ilastik et Flynotyper sont utilisés pour quantifier le phénotype oculaire de manière non biaisée.

Résumé

L’œil composé de Drosophila melanogaster est un ensemble bien structuré et complet d’environ 800 ommatidies, présentant un motif symétrique et hexagonal. Cette régularité et cette facilité d’observation font du système oculaire de la drosophile un outil puissant pour modéliser diverses maladies neurodégénératives humaines. Cependant, les moyens de quantifier les phénotypes anormaux, tels que le classement manuel des scores de gravité oculaire, ont des limites, en particulier lorsqu’il s’agit de classer les faibles altérations de la morphologie oculaire. Pour pallier ces limitations, des approches computationnelles ont été développées telles que Flynotyper. L’utilisation d’une lumière annulaire permet d’obtenir de meilleures images qualitatives en accédant à l’intégrité des ommatidies individuelles. Cependant, ces images ne peuvent pas être analysées directement par Flynotyper en raison des ombres sur les ommatidies introduites par la lumière annulaire. Ici, nous décrivons une manière impartiale de quantifier les phénotypes de l’œil rugueux observés dans des modèles de maladie de la drosophile en combinant deux logiciels, ilastik et Flynotyper. En prétraitant les images avec ilastik, il est possible de quantifier avec succès le phénotype de l’œil rugueux avec Flynotyper.

Introduction

Le génome de Drosophila melanogaster contient ~75% d’orthologues de gènes liés à des maladies humaines. De plus, au cours du développement de l’œil de la drosophile, environ deux tiers des gènes du génome sont exprimés, ce qui fait de l’œil de la drosophile un système génétique exceptionnel pour l’étude de diverses fonctions moléculaires et cellulaires, du développement et des modèles de maladies ^1,2. Ainsi, le système oculaire de la drosophile est un outil expérimental utile pour étudier divers processus biologiques.

L’œil composé de la drosophile est un ensemble bien structuré et complet de ~800 ommatidies qui présentent un motif symétrique et hexagonal³. La régularité de ce motif hexagonal peut être utilisée pour estimer l’effet de l’introduction de mutations et de changements d’expression génique dans la morphologie de l’œil⁴. Des études antérieures nécessitant une évaluation de la morphologie oculaire se sont fortement appuyées sur le classement manuel de la gravité des phénotypes oculaires détectés à l’œil nu. Pour classer les phénotypes oculaires, des images de la morphologie de l’œil externe sont prises par un stéréomicroscope ^5,6. Le phénotype oculaire de chaque groupe est évalué en divisant l’œil externe en quatre zones et en calculant la proportion de dégénérescence dans chaque zone ^5,6. Ensuite, les valeurs sont utilisées pour calculer des moyennes qui sont comparées aux valeurs obtenues à partir de mouches témoins⁷. L’évaluation est basée sur l’étendue de la fusion, la perte d’ommatidies et l’organisation des soies ^7,8. Les photos d’yeux de mouches prises au stéréomicroscope sont acquises par un chercheur, et l’analyse du phénotype oculaire est effectuée par un autre chercheur avec des ensembles de validation triples ^7,8.

Lorsqu’il s’agit de classer à l’œil nu les faibles altérations de la morphologie de l’œil, il y a des limites⁴. Pour surmonter ces limitations, des approches informatiques telles que FLEYE et Flynotyper ont été développées ^1,9. Flynotyper est une nouvelle méthode de calcul pour estimer quantitativement les changements morphologiques dans le système oculaire de la drosophile¹. Il détecte automatiquement l’œil de la drosophile et l’ommatidium individuel, en calculant les scores phénotypiques (P-Scores) basés sur l’irrégularité del’œil¹. Un P-Score plus élevé indique que l’œil de la mouche est plus dégénéré. Ce logiciel a été utilisé avec succès pour quantifier l’anomalie des yeux de la drosophile ¹⁰. Bien que Flynotyper garantisse un processus automatisé, il ne peut toujours pas être appliqué avec succès à certaines images oculaires prises par diverses méthodes de microscopie optique.

D’un point de vue qualitatif, nous préférons une source lumineuse annulaire par rapport à une source lumineuse à point unique, car elle offre une représentation plus précise de chaque ommatidium. Cependant, lorsque la lumière annulaire est utilisée, elle génère une ombre en forme d’anneau au sommet de chaque ommatidium en raison de la forme hémisphérique de l’ommatidium. Cette ombre en forme d’anneau empêche la détection précise de l’ommatidium par Flynotyper, ce qui entraîne un calcul incorrect des P-Scores.

Pour surmonter ces problèmes, nous avons mis en œuvre ilastik, un outil basé sur l’apprentissage automatique pour diverses analyses, afin de classer les ommatidies dans les images d’yeux de mouche¹¹. Nous avons ensuite introduit les images générées par ilastik dans Flynotyper pour calculer les P-Scores. Cela nous permet de quantifier les défauts morphologiques de l’œil de la drosophile de manière impartiale¹.

Protocole

1. Préparation à la quantification

1. Téléchargez et installez ilastik¹¹, ImageJ et le plugin ImageJ Flynotyper¹. Voir la table des matériaux pour les liens du site Web vers l’installation. Téléchargez les packages appropriés en fonction du système d’exploitation de l’ordinateur (Mac, Windows, Linux, etc.). Suivez les instructions d’installation à la lettre comme indiqué.
   REMARQUE : Il est impératif de suivre les instructions exactement comme indiqué dans les liens fournis. L’ordinateur utilisé a besoin d’un système d’exploitation 64 bits ; sinon, il n’y a pas d’autres spécifications requises. Voir la Table des matériaux pour les spécifications informatiques du système utilisé pour ce protocole.
2. Utilisez une image standard pour entraîner le modèle de machine learning. Prenez une image de l’œil d’une mouche saine à l’aide d’un microscope optique avec une lumière annulaire (tel que w1118 x GMR-GAL4), en utilisant le centre de l’œil comme point focal. Analyser les mâles et les femelles séparément ; Par conséquent, acquérez une image standard pour les hommes et pour les femmes.
   REMARQUE : Les paramètres varient considérablement en fonction du microscope et de l’appareil photo. Voir le deuxième paragraphe de la discussion pour des informations plus générales sur la préparation des mouches et l’acquisition d’images.
3. Prenez des images des yeux de mouche expérimentaux en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour l’acquisition d’images standard.
   REMARQUE : Une bonne orientation est primordiale pour une quantification précise. Voir la figure 4 à titre d’exemple pour une bonne orientation.

2. Utilisation d’ilastik pour détecter les ommatidies à partir d’images d’yeux de mouches

1. Avant de commencer l’analyse, assurez-vous que tous les groupes expérimentaux, quelle que soit leur condition, se trouvent dans le même dossier de fichiers afin de faciliter les processus suivants. Assurez-vous que les fichiers sont nommés de manière appropriée pour identifier les groupes expérimentaux et faire la distinction entre les mâles et les femelles.
   REMARQUE : Nous vous recommandons d’imprimer le protocole et d’utiliser l’ordinateur pour zoomer sur les chiffres, car ce protocole est plus facile à suivre visuellement.
2. Ouvrez le logiciel.
   REMARQUE : Il est conseillé de ne pas avoir d’autres applications ouvertes pendant l’exécution du logiciel ; Sinon, l’ordinateur peut fonctionner très lentement, en particulier dans les systèmes plus anciens ou moins robustes.
3. Cliquez sur Créer un nouveau projet | Autres flux de travail, choisissez Comptage de la densité de cellules, puis sélectionnez un emplacement pour enregistrer le fichier de projet (Figure 1A).
4. Cliquez sur 1. Données d’entrée | Ajouter un nouveau | Ajoutez une ou plusieurs images séparées. Choisissez l’image standard (Figure 1B).
5. Cliquez sur 2. Sélection de fonctionnalités et sélectionnez les fonctionnalités à utiliser. Sélectionnez les caractéristiques illustrées à la figure 1C ; Choisissez plus de valeurs Sigma pour augmenter la sensibilité (c’est-à-dire 10, 15, 20, etc.).
   REMARQUE : Si trop de cases sont cochées, le programme peut fonctionner pendant une longue période.
6. Cliquez sur 3. Compter et définir la valeur sigma de premier plan sur 5,00. Marquez 50 ommatidiums individuels ou plus à l’aide de l’outil Premier plan sur l’image standard.
   REMARQUE : Cinquante marques sont généralement suffisantes pour l’analyse ; cependant, plus il y a d’ommatidies marquées, plus les résultats seront précis (Figure 1D).
7. Cliquez sur 3. Compter et utiliser l’outil Arrière-plan pour marquer l’extérieur des ommatidies (Figure 1E). Tracez des lignes vertes en forme de treillis autour des ommatidies.
   REMARQUE : Semblable à plus de marques sur les ommatidies, plus il y a de lignes vertes dessinées, plus les résultats seront précis.
8. Cliquez sur 4. Exportation de densité | Choisissez Exporter les paramètres d’image pour définir les paramètres d’image (Figure 1F). Cliquez sur Informations sur le fichier de sortie | sélectionnez Format et tif pour une analyse plus approfondie dans Flynotyper.
9. Cliquez sur 5. Traitement par lots | Sélectionnez Fichiers de données brutes et sélectionnez toutes les photos expérimentales à analyser (Figure 1G). La liste des images importées à analyser s’affiche sous Sélectionner les fichiers de données brutes (Figure 1H). Cliquez sur Traiter tous les fichiers en bas de la barre 5. Section Traitement par lots .
   REMARQUE : Pour rappel, les analyses masculines et féminines doivent être effectuées séparément. Selon l’ordinateur utilisé, cette étape peut prendre 10 minutes ou plus, surtout s’il y a beaucoup d’images importées.
10. Une fois le logiciel terminé, vérifiez le même dossier de fichiers contenant les images expérimentales d’œil de mouche ; il y aura des images noires nommées « YourSampleName_Probabilities » (Figure 1I).

3. Utilisation d’ImageJ pour préparer des photos pour Flynotyper

1. Ouvrez le fichier .tif généré par ilastik (les boîtes noires) dans ImageJ.
   REMARQUE : Chaque fichier ilastik généré .tif doit être traité séparément.
2. Utilisez l’outil Sélection de rectangle pour créer un rectangle autour de l’œil. Une fois le rectangle dessiné, recadrez la zone en choisissant Ctrl + X ou Ctrl + C (Figure 2A). Attendez qu’une boîte noire en forme de contour rectangulaire apparaisse.
   REMARQUE : Le système d’exploitation de l’ordinateur déterminera s’il faut utiliser 'Ctrl + X' ou 'Ctrl + C'. Habituellement, 'Ctrl + X' est pour Windows et 'Ctrl + C’est utilisé pour Mac.
3. Ouvrez l’œil de mouche maintenant coupé à l’aide d’ImageJ ; cliquez sur Fichier | Nouveau | Presse-papiers interne (Figure 2B).
4. Enregistrez l’œil de mouche coupé au format JPEG en cliquant sur Fichier | Enregistrer sous | Jpeg. Les images découpées sont maintenant dans le même dossier que les images expérimentales originales.
   REMARQUE : Pour faciliter l’étape suivante, il est recommandé de créer un nouveau dossier de fichiers appelé « couper » et de mettre toutes les images coupées dans ce dossier.

4. Utilisation de Flynotyper pour calculer les scores phénotypiques

1. Ouvrez Flynotyper en tant que plugin ImageJ en cliquant sur Plugins | Mouche.
2. Sélectionnez Ajouter des génotypes et ouvrez le dossier contenant les images d’œil de mouche coupées (dossier de fichier coupé). Le nom du dossier s’affiche sous Génotypes (Figure 2C).
3. Cochez les cases Microscope optique et Vertical, mais ajustez en conséquence si nécessaire. Cochez les cases Stabilité et Distance par rapport au centre sous Rang Ommatidia par : (Figure 2C).
4. Pour le nombre d’ommatidies classées considérées, entrez 200.
   REMARQUE : En général, 200 est un bon nombre, mais ajustez en fonction des préférences.
5. Cliquez sur Exécuter et attendez que les résultats de l’analyse s’affichent (Figure 2D).
   REMARQUE : Cette étape peut prendre 5 minutes ou plus (ou moins) en fonction de la puissance de traitement de l’ordinateur utilisé.
6. Copiez et collez le fichier d’échantillonnage et le P-Score dans un logiciel statistique pour une analyse plus approfondie.

Résultats

Dans une étude précédente, nous avons utilisé ce protocole pour déterminer les modificateurs génétiques de la protéine VCP mutante liée à la sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale (ALS-FTD)¹². De plus, cette méthode a également été utilisée dans un autre article pour évaluer la toxicité de CHCHD10 ALS-FTD médiée par^S59L, même lors de l’utilisation d’un stéréomicroscope plus ancien¹³

Discussion

Les ommatidies de la drosophile constituent un système utile pour l’étude de diverses fonctions biologiques et maladies génétiques. La régularité des ommatidies est une bonne mesure pour examiner l’effet des mutations génétiques⁴. Même s’il existe plusieurs méthodes de calcul de la régularité ommatidienne, telles que le classement manuel, ces méthodes peuvent être fortement biaisées. Pour surmonter cette approche biaisée, des outils ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer specifications			Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10
Flynotyper	Iyer, J. et al. (2016)	Download software here: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	Open source software. Do not use Flynotyper 2.0. At the time of publication, 2.0 was fairly new and this protocol is optimized for the original version of Flynotyper.
ilastik	Berg, S. et al. (2019)	Download software here: https://www.ilastik.org/download.html	Open source software. Download Version 1.4.0.post1 under Regular Builds corresponding to your computer operating system.
ImageJ		Download software here: https://imagej.net/ij/download.html	Open source software. Versions 1.53 and 1.54 were used. 1.54 is the updated version and is the default download.
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems	LASX Office 1.4.6 28433	System and software used for z-stack acquisition.
Leica Z16 APO microscope with a DMC2900 camera	Leica Microsystems	10 447 173, 12 730 466	Referred to as Z-stack microscope and camera in the text. This product is now archived.