Analyse des interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique

Résumé

Ce protocole démontre l’utilisation d’une pince magnétique à molécule unique pour étudier les interactions entre les protéines de liaison à l’ADN télomérique (facteur de liaison à la répétition des télomères 1 [TRF1] et TRF2) et les télomères longs extraits de cellules humaines. Il décrit les étapes préparatoires pour les télomères et les facteurs de liaison de répétition télomérique, l’exécution d’expériences sur une seule molécule et les méthodes de collecte et d’analyse des données.

Résumé

Les télomères, les structures protectrices aux extrémités des chromosomes, sont cruciales pour maintenir la longévité cellulaire et la stabilité du génome. Leur bon fonctionnement dépend de processus étroitement régulés de réplication, d’allongement et de réponse aux dommages. Le complexe de la shelterine, en particulier le facteur de liaison répétée des télomères 1 (TRF1) et TRF2, joue un rôle central dans la protection des télomères et est devenu une cible anticancéreuse potentielle pour la découverte de médicaments. Ces protéines se lient au motif répétitif de l’ADN télomérique TTAGGG, facilitant la formation de structures protectrices et le recrutement d’autres protéines télomériques. Les méthodes structurelles et les techniques d’imagerie avancées ont permis de mieux comprendre les interactions protéine-ADN télomériques, mais l’exploration des processus dynamiques nécessite des approches à molécule unique. Des outils tels que les pinces magnétiques, les pinces optiques et la microscopie à force atomique (AFM) ont été utilisés pour étudier les interactions protéine-ADN télomériques, révélant des détails importants tels que la distorsion de l’ADN dépendante de TRF2 et la catalyse de la télomérase. Cependant, la préparation de constructions à molécule unique avec des motifs répétitifs télomériques continue d’être une tâche difficile, ce qui pourrait limiter l’étendue des études utilisant des méthodes mécaniques à molécule unique. Pour résoudre ce problème, nous avons développé une méthode pour étudier les interactions en utilisant de l’ADN télomérique humain complet avec des pinces magnétiques. Ce protocole décrit comment exprimer et purifier TRF2, préparer l’ADN télomérique, mettre en place des tests mécaniques monomoléculaires et analyser des données. Ce guide détaillé profitera aux chercheurs en biologie des télomères et à la découverte de médicaments ciblant les télomères.

Introduction

Les télomères sont des structures protectrices aux extrémités des chromosomes ^1,2,3. L’érosion des télomères pendant la division cellulaire entraîne la sénescence et le vieillissement cellulaires, tandis qu’un allongement anormal des télomères contribue au cancer ^4,5. Pour que les télomères fonctionnent correctement, leur réplication, leur allongement et leurs réponses aux dommages doivent être hautement régulés ^6,7,8

Protocole

1. Matériels et méthodes généraux

1. Reportez-vous au fichier de la Table des matériaux pour connaître les sels, les produits chimiques, les antibiotiques, les enzymes, les anticorps et les résines utilisés dans ce protocole.
2. Préparez le milieu liquide Luria-Bertani (LB), les plaques de gélose LB, le tampon HEPES, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE), le sérum salin tamponné au phosphate (PBS), le tampon Tris-EDTA (TE) selon les recettes des protocoles de port de source froide 45,46,47,48,49,50,51,52,53.

Discussion

Ce protocole utilise des pinces magnétiques pour la manipulation des TRF au niveau de la molécule unique 57,58,59. Nous utilisons des billes magnétiques pour séparer les TRF des fragments d’ADN génomique. Après la digestion par restriction, les TRF se lient aux billes magnétiques, ce qui permet de les séparer facilement des fragments d’ADN génomique. Cette approche permet la manipul.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Digoxigenin	Roche	11214667001
BfaI	New England Biolab (NEB)	R0568S
BSA	Sigma-Aldrich	V900933
CMOS camera	Mikrotron	MC1362
CviAII	New England Biolab (NEB)	R0640S
DIG-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-DIGXL
DNA extraction solution	G-CLONE	EX0108
Dnase I, Rnase-Free, Hc Ea	Thermo Fisher Scientific	EN0523
dNTP mixture	Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd (Vazyme)	P032-02
DTT	Solarbio	D1070
Dynabeads M-270  beads	Thermo Fisher Scientific	65305	Streptavidin beads
Dynabeads MyOne beads	Thermo Fisher Scientific	65001	Streptavidin beads
Ethanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	1083
Glycerol	Beijing Hwrkchemical Co,. Ltd	SMG66258-1
Imidazole	Solarbio	II0070
IPTG	Solarbio	I8070
Isopropanol	Tianjin No.6 Chemical Reagent Factory	A1079
Kanamycin	Thermo Fisher Scientific	EN0523
Klenow fragment (3′-5′ exo-)	New England Biolab (NEB)	M0212S
LabView	National Instruments	https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html	Graphical programming software
LiCl	Bide Pharmatech Co., Ltd (bidepharm)	BD136449
Lysozyme	Solarbio	L8120-5
MseI	New England Biolab (NEB)	R0525S
NaCl	Shanghai Aladdin	C111533
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific		Spectrophotometer
NdeI	New England Biolab (NEB)	R0111S
Ni NTA Beads 6FF	Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co.,Ltd	SA005025
Nitrocellulose membrane	ABclonal	RM02801
PMSF	Solarbio	P8340
Proteinase K	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	ST535-500mg
rCutSmart Buffer	New England Biolab (NEB)	B6004S
Rnase A	Sigma-Aldrich	R4875
Sodium acetate	SERVA Electrophoresis GmbH	2124902
Sumo protease	Beyotime Biotech Inc (beyotime)	P2312M