Contrôle spatio-temporel de l’activité des protéines par la régulation allostérique optogénétique

Résumé

Ce protocole décrit l’application d’un domaine d’interrupteur allostérique activé par la lumière bleue (LightR) pour un contrôle spatio-temporel réversible de l’activité protéique. En utilisant la tyrosine kinase Src comme modèle, cette étude propose un protocole élaboré pour développer et caractériser la Src régulée par la lumière (LightR-Src). Il démontre la polyvalence de cette approche dans toutes les classes d’enzymes.

Résumé

L’optogénétique offre la possibilité d’imiter un contrôle spatio-temporel complexe de l’activité enzymatique jusqu’à une résolution subcellulaire. Cependant, la plupart des approches optogénétiques sont souvent confrontées à des défis importants lorsqu’il s’agit d’intégrer plusieurs capacités dans un seul outil applicable à un large éventail de protéines cibles. Obtenir un contrôle précis de la cinétique ON/OFF, garantir une fuite minimale dans l’obscurité et démontrer des performances efficaces dans des cellules de mammifères avec une précision subcellulaire sont quelques-uns des défis les plus courants rencontrés dans ce domaine. Une solution prometteuse réside dans l’application de domaines sensibles à la lumière conçus de manière rationnelle pour contrôler allostériquement l’activité des protéines. En utilisant cette stratégie, nous avons généré une méthode optogénétique combinant toutes les caractéristiques souhaitées. L’approche implique l’incorporation du module de commutation allostérique régulé par la lumière (LightR) dans la protéine cible pour réguler l’activité enzymatique à l’aide de la lumière bleue (465 nm). Le domaine LightR est généré en liant deux domaines photorécepteurs Vivid (VVD), créant ainsi une pince sensible à la lumière qui peut être incorporée dans une petite boucle flexible au sein du domaine catalytique d’une enzyme. Dans son état sombre, la pince LightR est ouverte, déformant ainsi le domaine catalytique de l’enzyme et l’inactivant. Lors de l’exposition à la lumière bleue, le domaine LightR se ferme et restaure la structure et l’activité enzymatique du domaine catalytique. Dans ce manuscrit, nous discutons de stratégies de conception pour générer une protéine kinase régulée par la lumière et démontrons son contrôle par la lumière bleue, la réversibilité, la cinétique et la régulation précise au niveau subcellulaire, permettant une précision spatio-temporelle serrée. En utilisant la tyrosine kinase Src comme modèle, nous présentons un protocole pour réguler efficacement l’activité de la kinase LightR-Src. Nous démontrons également l’applicabilité de LightR à différentes classes d’enzymes, élargissant ainsi l’utilité du système d’outils pour répondre aux questions mécanistes des voies de signalisation dans différentes maladies.

Introduction

La capacité de la cellule à interpréter les signaux externes et à les convertir en réponses spécifiques dans des contextes physiologiques ou pathologiques est dirigée par des groupes de protéines dédiés. La contribution de toute protéine à des réponses aussi complexes est souvent définie par son emplacement subcellulaire, son niveau d’expression et le moment de l’activation transitoire, soutenue ou oscillatoire. Disséquer le rôle de ces paramètres individuels dans la régulation de la signalisation exige des méthodes capables de reproduire un contrôle spatio-temporel complexe de l’activité des protéines au niveau subcellulaire. Les techniques traditionnelles telles que la manipulation génétique et les inhibiteurs de petites molécules ne sont pas à la hauteur à cet égard. En revanche, les techniques optogénétiques promettent le potentiel de dissection des processus biologiques en manipulant ou en imitant les processus physiologiques et pathologiques. Cependant, les outils actuels manquent souvent d’applicabilité large ou de contrôle subcellulaire. Plusieurs stratégies existantes permettent une régulation stricte de la localisation et des interactions des protéines ; mais manque de contrôle direct sur l’activité enzymatique 1,2,3,4. D’autres permettent la régulation de l’activité enzymatique, mais peuvent manquer de contrôle subcellulaire ou avoir une applicabilité limitée dans différentes classes d’enzymes^{5, 6, 7, 8, 9}. Dans cet article de protocole, nous décrivons une nouvelle méthode d’ingénierie des protéines qui combine les avantages de l’optogénétique en un seul outil : régulation temporelle serrée, cinétique accordable, contrôle subcellulaire et large applicabilité enzymatique¹⁰. Nous avons conçu un domaine régulé par la lumière (LightR) qui fonctionne comme un interrupteur allostérique lorsqu’il est inséré dans la protéine cible d’intérêt. Cette stratégie permet un contrôle spatio-temporel étroit de l’activation et de la désactivation d’une protéine d’intérêt dans les cellules vivantes.

Ici, la stratégie de conception et d’application de l’outil optogénétique LightR dans plusieurs classes d’enzymes est discutée. Cette étude propose un protocole étape par étape pour le développement, la caractérisation et l’application de la tyrosine kinase Src régulée par la lumière (LightR-Src). L’étude démontre en outre l’accordabilité de la cinétique d’inactivation des commutateurs LightR. L’interrupteur LightR à inactivation lente peut maintenir l’activité enzymatique avec une fréquence d’éclairage réduite, tandis que la version à cycle rapide, FastLightR, nécessite un éclairage plus fréquent pour l’activation, mais montre une inactivation rapide lorsque l’éclairage est éteint. L’activation/inactivation de FastLightR-Src dans les cellules vivantes induit des cycles d’étalement et de rétraction cellulaires. L’étalement cellulaire induit par FastLightR-Src est en accord avec le rôle physiologique de la kinase^{Src 11,12}. En raison de la cinétique d’inactivation rapide, FastLightR-Src peut également être régulé à un niveau subcellulaire, ce qui entraîne une stimulation des protubérances locales et de la polarisation cellulaire. Pour démontrer l’applicabilité de l’outil LightR à d’autres types d’enzymes, nous guidons brièvement les lecteurs à travers un succès similaire avec la kinase bRaf régulée par la lumière (LightR-bRaf, FastLightR-bRaf) et une recombinase d’ADN Cre spécifique au site (LightR-Cre). Dans l’ensemble, cette approche a le potentiel de faire progresser notre compréhension des voies de signalisation complexes qui façonnent la physiopathologie de diverses maladies.

Protocole

1. Conception et développement de LightR (Figure 1)

1. Planification stratégique
   REMARQUE : Le domaine LightR est composé de deux domaines photorécepteurs Vivid (VVD) connectés en tandem de Neurospora crassa^13,14,15,16. Les VVD s’homodimérisent en présence de lumière, et une telle dimérisation implique un changement de conformation qui amène l’extrémité N-terminale d’un monomère VVD à côté de l’extrémité C-terminale d’un autre monomère VVD (Graphique 1A). La connexion de deux domaines VVD à l’aide d’un agent de liaison flexible crée un domaine en forme de pince qui sera ouvert dans l’obscurité et fermé lors de l’éclairage par lumière bleue. L’intégration de cette pince dans le domaine catalytique d’une enzyme permet une régulation de l’activité médiée par la lumière. Dans l’obscurité, la pince ouverte déforme le domaine, désactivant l’enzyme ; L’éclairage avec la lumière bleue provoque la fermeture de la pince, rétablissant l’activité de l’enzyme (Graphique 1B). Ce concept peut être appliqué à des enzymes de différentes familles, y compris les protéines kinases et les recombinases d’ADN¹⁰ (Graphique 1C).
   1. Conception de LightR
      1. Pour connecter deux molécules de VVD, utilisez un linker flexible de 22 acides aminés (GGS)4G(GGS)3 entre chaque monomère.
         REMARQUE : L’éditeur de liens offre une flexibilité et une longueur suffisantes pour permettre l’association et la dissociation des monomères VVD.
      2. Ajoutez les éditeurs de liens GPGGSGG et GSGGPG aux extrémités N et C du domaine LightR, respectivement.
         REMARQUE : La longueur et la composition des liants peuvent devoir être ajustées pour une protéine spécifique. Des linkers GSG plus courts et Gly simples sont couramment utilisés lorsqu’une régulation plus stricte est nécessaire. La taille de la boucle d’insertion et sa proximité avec les résidus catalytiques influenceront également la plage dynamique de régulation. Des boucles plus courtes sont plus susceptibles de fournir une régulation plus stricte de l’activité catalytique, mais peuvent entraîner une activité plus faible après l’éclairage. La séquence du domaine LightR est fournie dans le Tableau supplémentaire 1.
   2. Insertion de la lumière
      REMARQUE : Un site d’insertion LightR approprié permettra une régulation stricte de la fonction du domaine ciblé sans bloquer stériquement ses interactions ni provoquer de changements structurels irréversibles qui affecteront son rôle biologique. Une structure cristalline de la protéine cible est un guide idéal dans l’identification de ces régions de boucle flexibles pour l’insertion de LightR. Si nécessaire, la structure cristalline d’un homologue proche peut suffire. Certains critères généraux à prendre en compte sont présentés ci-dessous.
      1. Assurez-vous que la boucle d’insertion est structurellement couplée aux éléments catalytiques critiques de l’enzyme. Assurez-vous que la boucle d’insertion sélectionnée n’est pas un site de liaison existant pour la protéine et que l’insertion de LightR ne perturbe pas potentiellement les interactions fonctionnelles dues à des effets stériques.
      2. Comme stratégie initiale, remplacez un acide aminé dans la boucle d’insertion lors de l’insertion de LightR. Ciblez le milieu de la boucle d’insertion contenant un acide aminé polaire ou petit (par exemple, Glu, Arg, Lys, Gly) exposé au solvant et non impliqué dans les interactions intramoléculaires.
         REMARQUE : Lorsqu’un remplacement d’acide aminé n’aboutit pas à une protéine fonctionnelle, l’optimisation de la construction LightR nécessitera le remplacement de plusieurs acides aminés ou de la boucle d’insertion entière. Évaluez la fonctionnalité de plusieurs sites d’insertion pour LightR dans la boucle définie.
      3. S’assurer que l’enzyme cible fonctionne indépendamment de la régulation endogène. Pour ce faire, utilisez une version mutante constitutivement active de l’enzyme pour le modèle d’insertion.
         REMARQUE : Des enzymes de type sauvage peuvent également être utilisées pour générer des constructions LightR, mais cela peut aboutir à un système AND-gate qui sera régulé par des mécanismes endogènes et la lumière.
      4. Les contrôles positifs et négatifs sont essentiels pour l’analyse de l’activité enzymatique LightR. Utilisez des mutants constitutivement actifs de protéines endogènes comme témoins positifs et des versions mutantes catalytiquement inactives de l’enzyme LightR ciblée comme contrôles négatifs.
         REMARQUE : Lors de la sélection de mutations inactivantes, il est crucial de s’assurer que la mutation est suffisamment espacée du site d’insertion de LightR pour éviter de perturber l’irréversibilité du repliement de l’enzyme LightR. Sur la base des critères ci-dessus, le site d’insertion de LightR dans la kinase Src est sélectionné dans une région de boucle flexible qui est structurellement couplée au motif GXGXXG hautement conservé dans la région de la boucle G/glycine de liaison à l’ATP via un brin bêta. Il est important de noter qu’il est positionné à l’écart de la poche de liaison ATP et de la région de liaison du substrat^10,17 (Figure 1C (i)).
         REMARQUE : En raison de l’homologie structurelle entre les kinases, le site d’insertion de LightR dans bRaf est sélectionné dans la même boucle structurelle que le site d’insertion dans Src (Figure 1C (ii)).
         REMARQUE : Sur la base des principes énoncés à la section 1.1.2., le site d’insertion de LightR dans la recombinase Cre, une non-kinase, est prélevé dans l’une des boucles flexibles éloignées du noyau catalytique, c’est-à-dire le site de liaison à l’ADN. Cependant, la boucle d’insertion est toujours structurellement couplée aux résidus catalytiques critiques dans le domaine de liaison à l’ADN par le biais d’une hélice α pour assurer le succès de la fonctionnalité LightR-Cre (Figure 1C (iii)). Tous les sites d’insertion avec des témoins positifs et négatifs pour différentes enzymes décrites dans le protocole actuel sont détaillés dans le tableau supplémentaire 2.
   3. Développement de FastLightR.
      REMARQUE : L’introduction de la mutation I85V dans les deux VVD de LightR permet une dynamique d’activation-inactivation plus rapide, attribuée à la conversion rapide du mutant à l’état sombre^18,19. La génération de FastLightR-Src et FastLightR-bRaf avec une cinétique d’inactivation rapide permet un contrôle temporel précis de l’activation et de l’inactivation. Il permet d’obtenir une régulation subcellulaire de LightR-Src dans les cellules vivantes.
      REMARQUE : L’activité de la cre recombinase entraîne une recombinaison irréversible de l’ADN ; par conséquent, les propriétés de réversibilité de LightR ne sont pas applicables.
      REMARQUE : Pour simplifier la détection de la construction LightR, une protéine fluorescente ou toute autre étiquette appropriée peut être attachée à l’extrémité N ou C de la protéine cible. Cette étude a utilisé mCherry-myc pour LightR-Src, Venus pour LightR-bRaf et miRFP670 pour la recombinase LightR-Cre.
2. Stratégie de clonage
   REMARQUE : L’approche de clonage, contrairement aux approches traditionnelles, est basée sur la mutagénèse dirigée qui ne repose pas sur des sites de restriction spécifiques^10,20.
   1. Génération d’un « Megaprimer »
      1. Optimiser les gènes LightR pour assurer une expression stable des deux séquences d’ADN VVD en tandem d’origine fongique dans les cellules de mammifères et pour rendre les séquences aussi différentes que possible pour un clonage sans erreur par PCR. Pour effectuer l’optimisation des codons, suivez les étapes 1.2.1.2-1.2.1.3.
      2. Alignez la séquence d’acides aminés des VVD et les linkers sélectionnés côte à côte pour créer la carte de séquence théorique de LightR.
      3. Collez la séquence dans n’importe quelle plateforme d’optimisation de codons en ligne qui utilise un algorithme avancé pour l’optimisation des codons afin de déterminer la meilleure option de séquence avec une complexité minimale. Assurez-vous que l’organisme cible est sélectionné, que le cadre de lecture est maintenu et que les séquences VVD sont sélectionnées pour l’optimisation.
      4. Obtenez de l’ADN LightR sous forme de fragment synthétisé sur mesure (voir le tableau supplémentaire 1) ou à partir d’une construction^{LightR 10} précédemment publiée.
      5. Amplifier le gène LightR pour générer « Megaprimer » en utilisant la stratégie²⁰ décrite précédemment décrite à la figure 1D. Synthétisez le LightR « Megaprimer » par PCR en suivant les recommandations du fabricant pour l’ADN polymérase spécifique et en utilisant le mélange de réaction PCR suivant :
         5x tampon compatible ADN polymérase : 10 μL
         100 μM Mégaamorce directe : 0,5 μL
         Mégaamorce inversée 100 μM : 0,5 μL
         Mélange dNTP 10 nM : 2 μL
         ADN polymérase (2000 unités/mL) : 1 μl (0,02 U/μL)
         50 ng d’ADN matrice : 1 μL
         Eau de qualité PCR : 35 μL
         REMARQUE : Ici, l’ADN polymérase haute fidélité, à démarrage à chaud avec des températures de recuit d’amorce universelles est utilisée.
      6. Séparez le méga-amorce résultant par électrophorèse sur gel d’agarose. Le produit aura une longueur d’environ 1000 nucléotides. Exciser le mégaamorce du gel d’agarose et le purifier à l’aide d’un kit d’extraction de gel, en suivant les recommandations du fabricant ou en utilisant une technique analogue.
   2. Insertion du gène LightR par mutagenèse dirigée : Insérez le LightR, en remplaçant un acide aminé souhaité ou une longueur d’acides aminés. Le plasmide matrice sera celui où le domaine LightR est inséré. Effectuez la réaction PCR décrite précédemment²⁰ en utilisant le mélange suivant.
      5x tampon compatible ADN polymérase : 5 μL
      Mélange dNTP 10 nM : 1 μL
      ADN polymérase (2000 unités/mL) : 1 μL (0,02 U/μL)
      50 ng d’ADN modèle cible : 1 μL
      Mégaamorce extraite (masse calculée) : 10 μL
      DMSO : 2,5 μL
      Eau de qualité PCR : 2,5 μL
      REMARQUE : Masse de la mégaamorce (ng) = rapport molaire insert/vecteur souhaité x masse du vecteur x rapport entre les longueurs de l’insert et du vecteur. Le rapport insert/molaire vectoriel souhaité utilisé est de 3/1.
   3. Une fois la réaction PCR terminée, ajouter 1 μL d’enzyme DpnI (2000 unités/mL) pour digérer sélectivement uniquement l’excès d’ADN méthylé et incuber le mélange à 37 °C pendant 1 à 1,5 h. Cela augmentera considérablement le rendement de la construction modifiée.
   4. Transformez 1 à 2 μL de la réaction PCR en cellules compétentes DH5α selon les protocoles du fabricant.
   5. Plaque de bactéries transformées sur une plaque de gélose Luria Broth (LB) avec l’antibiotique approprié pour la sélection. Incuber la plaque à 37 °C pendant la nuit ou à température ambiante (RT ; 25-30 °C ) pendant 72 h.
      REMARQUE : Les plaques LB sur lesquelles poussent des colonies peuvent être stockées à 4 °C jusqu’à 1 mois, et le protocole peut être mis en pause.
   6. Dépistage de colonie PCR
      1. Pour le criblage de colonies basé sur la PCR, concevez des amorces qui recuit dans l’insert LightR et ciblent l’ADN pour générer des fragments d’environ 400 à 700 pb.
      2. Ajoutez une petite quantité d’une colonie de la plaque LB au mélange de PCR fourni ci-dessous et procédez au thermocyclage en suivant les recommandations du fabricant pour l’ADN polymérase spécifique.
         2x Taq RED Master Mix : 5 μL
         Eau de qualité PCR : 5 μL
         100 μM Amorce avant : 0,5 μL
         100 μM Amorce inversée : 0,5 μL
      3. Vérifiez les colonies positives par électrophorèse sur gel d’agarose.
      4. Choisissez les colonies qui ont généré la taille de produit PCR souhaitée et inocunez-les individuellement dans 3 ml de bouillon LB avec l’antibiotique, correspondant à la résistance aux antibiotiques dans le squelette plasmidique. Ensuite, incubez et agitez à 37 °C pendant la nuit.
      5. Extraire l’ADN plasmidique d’une culture liquide en suivant les instructions du fabricant du kit de purification du plasmide pour l’extraction de l’ADN plasmidique et vérifier la présence de l’insert par séquençage.
         REMARQUE : Les amorces de clonage sont résumées dans le tableau supplémentaire 3.

2. Placage cellulaire et analyse biochimique de l’activité enzymatique LightR (Figure 2A)

1. Pour l’analyse biochimique des LightR-kinases (LightR Src, FastLightR Src, LightR bRaf), plaque 1 x 10 6 cellules LinXE par boîte de culture cellulaire de 3,5 cm pour chaque groupe expérimental. Voir le tableau supplémentaire 4.
2. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 16 à 18 h.
3. Le lendemain, transfectez les cellules avec la construction d’ADN sélectionnée, à l’aide d’un réactif de transfection approprié en suivant les recommandations du fabricant (tableau supplémentaire 4).
   REMARQUE : Le réactif de transfection optimal dépendra de la construction, du vecteur et du type de cellules utilisées. Cette étude a utilisé 2 μg d’ADN dans une boîte de 3,5 cm à l’aide d’un réactif de transfection. Des tests empiriques doivent être effectués pour déterminer le réactif de transfection optimal. Étant donné que les constructions transfectées expriment des protéines régulées par la lumière bleue, toutes les étapes ultérieures de manipulation des cellules transfectées doivent être effectuées sous lumière rouge. Enveloppez les plaques avec des cellules transfectées avec du papier d’aluminium avant de les placer dans l’incubateur pour éviter tout allumage accidentel.
4. Après 16-18 h de transfection, exposez les cellules à la lumière bleue¹⁰. Pour ce faire, placez un système de lampe à diode électroluminescente (LED) de 465 nm dans l’incubateur de culture tissulaire. Placez un panneau en plexiglas perforé à 10 cm au-dessus de la lampe pour obtenir l’éclairage souhaité de 3 mW/^cm2 (Dossier supplémentaire 1). Un panneau perforé est nécessaire pour maintenir une circulation d’air ininterrompue dans l’incubateur. Illuminez les cellules pendant la période souhaitée.
5. Pour l’activation de LightR-Src et LightR-bRaf, utilisez un éclairage continu. Pour un éclairage continu, allumez et éteignez le panneau LED manuellement.
6. Pour maintenir le cycle d’activation/inactivation de FastLightR Src, utilisez des cycles ON/OFF contrôlés manuellement ou par un microcontrôleur.
   REMARQUE : plusieurs boîtes à outils logicielles qui fournissent un environnement de développement intégré (IDE) pour l’écriture et le téléchargement du code requis peuvent être utilisées. Ces boîtes à outils prennent en charge la programmation C/C++ et offrent un accès GPIO (General Purpose Input/Output), ce qui est essentiel pour contrôler l’éclairage pulsé. Une description détaillée des protocoles et du code utilisés à ces fins est décrite dans le Fichier supplémentaire 1.
7. À la fin des points temporels respectifs de l’expérience (tableau supplémentaire 4), récoltez les cellules sous des feux rouges sûrs. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS froid.
8. Pour isoler la protéine, lyser les cellules avec 500 μL de tampon d’échantillon 2x Laemmli complété par 5% v/v de 2-Mercaptoéthanol. Incuber le lysat à 100 °C pendant 5 min. Analysez les lysats cellulaires par électrophorèse sur gel de protéines et Western blot²¹.
   REMARQUE : La composition de 2x tampon Laemmli est la suivante : Pour 500 mL : 5,18 g de Tris-HCL, 131,5 mL de glycérol, 52,5 mL de 20% SDS, 0,5 g de bleu de bromophénol, pH final 6,8.
9. Évaluer l’activité de LightR-Src en évaluant le niveau de phosphorylation de p130cas endogènes sur Tyr249 et de paxillin sur TyrY118^22,23 (Figure 2). Evaluez l’activité de LightR-bRaf en évaluant le niveau de phosphorylation de MEK1 sur Ser217/221 et ERK1/2 sur TyrY202/204 ^24,25.

3. Analyse fonctionnelle de l’activité LightR-Cre

1. Pour l’analyse fonctionnelle de l’activité LightR-Cre, plaquer 1 x 10⁶ cellules LinXE par boîte de culture cellulaire de 3,5 cm. Incuber les cellules à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 16 à 18 h.
2. Transfectez les cellules en suivant le protocole décrit à la section 2, figure 2A, et au tableau supplémentaire 5. Co-transfectez un total de 2 μg d’ADN, avec un rapport de 1:9 de LightR-Cre-iRFP670 et d’un plasmide rapporteur Floxed-STOP-mCherry².
3. Après 16-18 h après la transfection, illuminez les cellules. Une activation efficace de LightR-Cre nécessite un éclairage prolongé. Par conséquent, pour éviter la phototoxicité, utilisez un éclairage pulsé pendant 8 h avec des cycles de marche de 2 s et d’arrêt de 20 s à l’aide d’un système de lampe à panneau LED de 465 nm contrôlé par un microcontrôleur, comme détaillé dans la section 2 et le fichier supplémentaire 1.
4. Effectuez l’imagerie à l’aide de la microscopie à épifluorescence avec un objectif à air 20x. Pour la visualisation de LightR-Cre-iRFP670, utilisez le jeu de filtres Cy5, et pour la visualisation de mCherry à partir de l’expression Floxed-mCherry, utilisez le jeu de filtres RFP.
   REMARQUE : Pour l’imagerie, un microscope à épifluorescence équipé de cubes lumineux Cy5/RFP est utilisé.

4. Préparation d’échantillons pour l’imagerie de cellules vivantes

1. Plaquez 2 x 10⁵ cellules HeLa par boîte de culture tissulaire de 35 mm dans un milieu de culture cellulaire et incubez pendant 2 h à 37 °C et 5% de CO₂.
2. Une fois que les cellules se sont fixées et que la confluence est d’environ 60 % à 70 %, co-transfectez les cellules HeLa avec l’un des mélanges suivants : (i) 0,85 μg de FastLightR-Src-mCherry-myc/0,15 μg de Stargazin-iRFP, ou (ii) 0,75 μg de FastLightR-bRaf-Venus/0,25 μg de mCherry-ERK2
   REMARQUE : Dans les expériences FastLightR-Src, le Stargazin-iRFP est utilisé pour marquer la membrane plasmique pour l’analyse de l’étalement cellulaire. Si une expression plus élevée de FastLightR-Src est souhaitée, stargazin-iRFP peut être omis, et 1 μg de FastLightR-Src peut être utilisé à la place. Dans ces cas, un colorant membranaire doit être utilisé pour visualiser les cellules. Les colorants de membrane plasmique sont couramment utilisés pour le marquage des membranes cellulaires.
3. Couvrir le plat d’une feuille d’aluminium pour éviter l’allumage accidentel des cellules et incuber pendant 16-18 h à 37 °C et 5% de CO₂.
4. Effectuez toutes les étapes suivantes sous l’éclairage d’un voyant rouge pour éviter l’activation par inadvertance des constructions. L’exposition à la lumière blanche induira l’activation des LightR-kinases et pourrait affecter les résultats ultérieurs.
5. Le même jour, enduire pendant la nuit 3 lamelles rondes en verre (25 mm de diamètre, 0,17 mm d’épaisseur) avec 5 mg/L de fibronectine dans du PBS à 37 °C.
6. Rincez les lamelles avec du PBS 16-18 h après la transfection et plaquez ~1 x 10⁵ cellules HeLa transfectées sur chaque lamelle. Incuber dans un milieu de culture cellulaire pendant 2 h à 37 °C et 5% de CO₂.
   REMARQUE : La faible densité d’ensemencement est nécessaire pour s’assurer que les cellules dans le champ de vision ne se touchent pas.
7. Préparez le support d’imagerie en ajoutant du FBS au support d’imagerie L-15 de Levobitz jusqu’à une concentration finale de 5 %. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μm et réchauffez-la à 37 °C.
8. Préchauffer l’huile minérale à 37 °C.
9. Lavez deux fois les lamelles contenant les cellules avec du PBS. Si vous utilisez un colorant pour membrane, colorez les cellules en suivant les instructions du fabricant avant de laver les lamelles.
10. Placez délicatement la lamelle dans une chambre d’imagerie de cellules vivantes. Ajouter 1 mL de support d’imagerie L-15 dans la chambre.
11. Ajoutez 1 mL d’huile minérale sur le dessus du support pour éviter l’évaporation pendant le processus d’imagerie.
12. Conservez la chambre à l’abri de la lumière à 37 °C jusqu’à ce que vous soyez prêt à prendre des images.

5. Activation et imagerie globales de FastLightR-Src (Figure 3)

1. Fixez un anneau lumineux de microscopie à LED bleue au condensateur du microscope, en le positionnant à environ 1,5 cm au-dessus du porte-échantillon. Connectez le relais de commande AC/DC pour la lumière annulaire à l’ordinateur du microscope.
   REMARQUE : Pour les expériences de cette étude, l’éclairage a été contrôlé par une interface TTL (Transistor-Transistor Logic) via le logiciel d’imagerie. L’éclairage épifluorescent peut également être utilisé pour activer globalement les constructions LightR si une source d’éclairage externe n’est pas disponible. Les longueurs d’onde d’excitation GFP, telles que le filtre d’excitation 490/20 nm, sont efficaces pour activer LightR.
2. Placez la chambre sur une platine de microscope préchauffée à 37 °C et sélectionnez des cellules exprimant FastLightR-Src-mCherry et Stargazin-iRFP (Figure 3B) ou FastLightR-bRaf-Venus et mCherry ERK-2 (Figure 5B).
3. Pour l’étude d’expériences d’illumination globale et d’imagerie, utilisez des objectifs haute performance compatibles avec les microscopes (40x) avec correction apochromatique, correction de champ plat et ouverture numérique élevée.
   1. Pour les études basées sur l’illumination globale de la kinase Src, utilisez des filtres d’excitation 561/10 nm et d’émission 595/40 nm pour visualiser FastLightR-Src-mCherry et utilisez une excitation 640/20 nm et un filtre d’émission 655LP pour visualiser stargazin-iRFP.
   2. Pour les études basées sur l’illumination globale de la kinase bRaf, utilisez des filtres d’excitation 514/10 nm et d’émission 540/21 nm pour visualiser FastLightR-bRaf-Venus et utilisez des filtres d’excitation 561/10 nm et d’émission 595/40 nm pour visualiser mCherry-ERK-2.
   3. Utilisez un miroir polychroïque multibande dans tous les canaux d’imagerie fluorescente.
4. En fonction des conditions expérimentales, tenez compte des recommandations suivantes.
   1. Imagez les cellules pendant au moins 10 minutes avant l’illumination pour établir une activité de base des cellules.
      REMARQUE : Cette base de référence est nécessaire pour déterminer si l’activation de la kinase FastLightR par l’éclairage induit des changements dans le comportement cellulaire ou la localisation des protéines. On peut également effectuer des périodes plus longues d’imagerie basale pour fournir une plus grande signification statistique.
   2. En raison de la cinétique d’inactivation rapide des FastLightRs, l’inclusion de nombreuses cellules pour l’imagerie peut provoquer la désactivation de Src/bRaf entre les positions de la platine et peut atténuer sa réponse. Pour éviter une telle erreur, imagez 4 cellules/min lors de l’analyse de l’activité de FastLightR-Kinase dans le protocole décrit et imagez chaque cellule sélectionnée toutes les minutes pour un total de 110 min (Fichier supplémentaire 2).
   3. Utilisez un éclairage pulsé plutôt qu’un éclairage continu pour réduire les effets phototoxiques potentiels de la lumière bleue. L’éclairage pendant 12 s pour chacune des 4 cellules/min est efficace (Fichier supplémentaire 2, Figure 3A).
      REMARQUE : Les cycles d’éclairage doivent être déterminés empiriquement pour différentes constructions et types de sources d’éclairage.
   4. Désactivez l’éclairage pendant l’imagerie cellulaire pour éviter les fuites dans les canaux fluorescents.
      REMARQUE : L’imagerie d’un trop grand nombre de cellules à la fois réduira le temps total d’éclairage disponible pour l’échantillon, entraînant une réponse atténuée due à une activation insuffisante.
5. Après l’imagerie, enregistrez les films au format . Format de fichier de pile TIF pour l’analyse.
   REMARQUE : En raison de l’éclairage moins uniforme avec l’épifluorescence GFP par rapport à la lumière annulaire, les expériences utilisant l’épifluorescence GFP nécessiteront un éclairage plus fréquent. Cela se traduit par un nombre réduit de cellules imagées par expérience.

6. Activation subcellulaire et imagerie de FastLightR-Src (Figure 4)

1. Placez la chambre sur une platine de microscope préchauffée à 37 °C et sélectionnez une seule cellule exprimant à la fois FastLightR-Src-mCherry et Stargazin-iRFP.
2. Sélectionnez les régions spécifiques (ROI) dans la cellule à éclairer. Cette étude choisit une petite zone à la périphérie de la cellule sélectionnée.
   REMARQUE : Pour l’éclairage local, un laser de 445 nm focalisé par un module TIRF en mode FRAP ou un dispositif à micro-miroir contrôlé via l’interface TTL via le logiciel d’imagerie est utilisé. N’importe quel système d’éclairage à motifs fonctionnera pour ces expériences. Si un système basé sur le balayage est utilisé, déterminez l’intensité et l’homogénéité du laser pour une activation suffisante sans endommager la cellule.
3. Imagez la cellule sélectionnée toutes les minutes pendant 20 min à l’état basal avant l’éclairage, 50 min en éclairant localement, puis 20 min après l’activation pour un total de 90 min (Fichier supplémentaire 2).
4. Pour l’activation et la désactivation, prévoyez une durée appropriée pour la protéine cible afin de permettre la désactivation complète de la protéine LightR. Pour FastLightR-Src, prévoyez au moins 10 min de désactivation pour l’ablation de l’activité résiduelle et autorisez 20 min de désactivation dans la configuration expérimentale démontrée pour l’éclairage local.
5. Après l’imagerie, enregistrez les films sous le nom . Format de fichier de pile TIF pour l’analyse.

7. Analyse de l’étalement cellulaire

1. Préparer les images pour le traitement et l’analyse des données. Assurez-vous que les images sont dans un fichier . Format de pile TIF. Enregistrez-les directement à partir du logiciel d’imagerie ou convertissez-les à l’aide d’un programme open source.
2. Téléchargez le package de script CellGeo à partir des fichiers compressés de données supplémentaires²⁶.
   REMARQUE : Le package CellGeo contient plusieurs scripts différents. Choisissez le package souhaité dans la liste en fonction du type d’analyse, comme couvert dans les sections 7 à 9 du protocole.
3. Ouvrez et exécutez le script intitulé MovThresh pour créer un masque de la cellule.
   1. Sélectionnez Fichier > Importer (.tif) et sélectionnez les images Stargazin-iRFP des cellules.
   2. Numérisez les cadres à l’aide de la barre de défilement dans le coin inférieur gauche. Si le seuil suggéré est approprié, passez à l’étape 7.4.
   3. Si le seuil suggéré ne correspond pas au comportement de la cellule, choisissez des courbes lissées ou personnalisées sous Sélection de courbe. Créez la courbe personnalisée en faisant défiler les cadres, puis en ajustant le seuil sur le côté droit de la fenêtre.
   4. Cliquez sur Re-seuil.
   5. Cliquez sur Fichier > Enregistrer en tant que masques, modifiez le nom du fichier et enregistrez-le à l’aide de l’option Enregistrer sous .
4. Ouvrez le fichier de pile nouvellement créé dans un programme d’analyse d’images open source.
5. Sélectionnez Image > Ajustez > seuil > Appliquer.
6. Sélectionnez Analyser > Analyser les particules > Vérifier les résultats d’affichage -> OK.
7. Calculez la variation de surface de chaque cellule en divisant la surface à un moment donné par la surface moyenne de la même cellule avant l’irradiation à la lumière bleue.
8. Tracez le changement de zone sous forme de graphique linéaire ou à barres.
9. Calculez la valeur moyenne et les intervalles de confiance à 90 % pour chaque point temporel de toutes les cellules traitées dans les mêmes conditions.

8. Analyse de la dynamique des bords de cellule

1. Préparez les fichiers de pile en suivant les étapes décrites dans la section 7 du protocole.
2. Ouvrez et exécutez le script intitulé ProActive.
   1. Sélectionnez Fichier > Importer > masques (.tif) et sélectionnez le masque créé via le script MovThresh .
   2. Sélectionnez l’activité d’analyse qui vous intéresse dans le coin inférieur droit (Protrusive, Rétractive ou Totale).
   3. Sélectionnez le type de normalisation. En règle générale, la normalisation de zone est utilisée pour ces analyses.
   4. Sélectionnez le cadre de référence de début à l’aide du curseur situé à gauche. Le curseur de décalage sur la droite déterminera le décalage temporel entre deux points de temps utilisé pour mesurer la zone gagnée et perdue par la cellule.
   5. Si l’image sélectionnée et le nombre de décalage sont supérieurs au nombre d’images de la vidéo, l’image d’aperçu ne s’affichera pas. Réinitialisez ces valeurs pour qu’elles soient inférieures au nombre total d’images.
3. Modifiez le seuillage de la saillie ou de la rétraction en cochant la case Courbe lisse dans la section Résultats . Il s’agit de faire la moyenne des seuils sur une fenêtre spécifique, ce qui permet de résoudre les problèmes où des fluctuations mineures sont détectées en tant qu’activité.
4. Sélectionnez Exécuter la plage pour calculer l’activité sur la durée spécifiée par les curseurs d’image et de décalage.
5. Enregistrez les données numériques en sélectionnant Fichier > Enregistrer sous > résultats (.mat) et utilisez-les pour déterminer l’activité protrusive ou rétractactive moyenne.
6. Déterminez les intervalles de confiance à 90 % pour chaque point temporel.
   REMARQUE : Cela enregistrera un tableau de plusieurs valeurs différentes. Le fichier texte « Comment utiliser ProActive » inclus avec le script fournit une description détaillée de ce que chaque valeur représente et de la façon dont elles ont été déterminées²⁶.
7. Enregistrez la représentation visuelle de l’activité en sélectionnant Fichier > Enregistrer sous > images (.tif).

9. Analyse du décalage du centroïde

1. Pour l’analyse du décalage du centroïde, utilisez n’importe quel logiciel capable de déterminer les coordonnées du centroïde.
2. Dans le logiciel d’analyse, ouvrez la pile d’images masquées de la cellule d’intérêt comme décrit dans la section 7 du protocole.
3. Sélectionnez Mesurer > Analyse morphométrique intégrée, puis cliquez sur Préférences > Dessiner une marque de centroïde > Vérifier, puis sélectionnez Mesurer.
   1. Enregistrez les coordonnées du centroïde avant le mouvement (A).
   2. Notez les coordonnées du centroïde à la fin de l’expérience (B).
   3. Notez les coordonnées du centre du motif d’éclairage (C).
4. Maintenant que les trois points ont été collectés, déterminez l’angle BAC⁸. θ₁ correspond à l’angle ABC et θ₂ correspond à l’angle CBA (Figure 4Cii). Pour ce faire, utilisez l’équation suivante :
   cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   REMARQUE : Une calculatrice peut être utilisée pour déterminer les angles et les distances directement à partir des coordonnées pour faciliter l’utilisation.
5. Déterminez le déplacement du centroïde en multipliant la distance parcourue par le centroïde cellulaire en pixels par le facteur de conversion où 1 pixel est égal à 0,4 μm. La conversion spécifique des pixels en distance dépendra du grossissement et de la configuration de l’appareil photo sur le système.
6. Une fois l’angle et la distance de décalage du centroïde déterminés, ouvrez un logiciel graphique capable de produire des images des coordonnées polaires.
7. Insérez l’angle de décalage du centroïde comme mesure θ et la distance parcourue comme rayon. Utilisez l’ANOVA pour tester les intervalles de confiance à 95 %.
8. Tracez les résultats et enregistrez l’image.

Résultats

Le LightR-Src est conçu et généré selon la stratégie décrite dans la figure 1A,B. L’analyse biochimique de LightR-Src accède à la phosphorylation de substrats endogènes connus de Src, p130Cas (Y249)²² et paxillin (Y118)²³ en réponse à la lumière bleue à 60 min d’éclairage continu (Figure 2B). Notamment, aucune activation de fond de la kinase Src n...

Discussion

Notre étude présente une approche optogénétique pour l’étude de diverses voies de signalisation et démontre sa large applicabilité pour répondre à différentes questions biologiques. Le système d’outils LightR offre plusieurs avantages essentiels : (1) Régulation allostérique de l’activité protéique, (2) Contrôle temporel serré de l’activité qui peut être ajusté pour obtenir différentes cinétiques d’activation et d’inactivation, (3) Résolution spatiale d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 Glass Coverslips 25 mm Round	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL Tubes	USA Scientific	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			For 500 mL: 5.18 g of  Tris-HCL, 131.5 mL of glycerol, 52.5 mL of 20% SDS, 0.5 g of bromophenol blue, final pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer	Thermo Scientific	F538L
60 LED Microscope Ring Light	Boli Optics	ML46241324	Blue LED, 60 mm diameter, 5 W
Agarose	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 Antibody	Cell Signaling	9102
Anti-GAPDH Antibody	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
Anti-mCherry Antibody	invitrogen	M11217
Anti-MEK	Cell Signaling	9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
Anti-paxillin	Cell Signaling	2542
Anti-phospho-Erk 1/2 T202/Y204 Antibody	Cell Signaling	9101
Anti-phospho-pY249 p130Cas	Cell Signaling	4014
Anti-phospho-Y118 Paxillin	Cell Signaling	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell Signaling	9121
Arduino Compatable Power Supply	Corporate Computer	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎A000066
Attofluor Cell Chamber	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini Bio-products	100-106	Heat Inactivated Triple 0.1 µm sterile-filtered
bRaf-V600E-Venus			Gift from Dr. John O'Bryan, MUSC
BSA	GoldBiotech	A-420
Carbenicillin (Disodium)	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red plasma membrane dye	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a competent cells	NEB	C2987H
DMEM	Corning	15-013-CV
DNA Ladder	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 Enzyme	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol, Cleland's Reagents
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141
FuGENE(R) 6 Transfection Reagent	Promega	E2692	Transfection reagent
Gel Green Nucleic Acid Stain	GoldBio	G-740-500
Gel Loading Dye Purple 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel extraction Kit	Thermo Scientific	K0692	Gel Extraction Kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 mL
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-11268
HeLa Cells	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
Iot Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	AC/DC control relay for illumination
Kanamycin Monosulfate	Gold Biotechnology	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-CV
LB Agar	Fisher	BP1425-2
LED Grow Light System	HQRP	884667106091218	LED panel lamp system
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	Software for running CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular Devices		Imaging Analysis Software
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
Mineral Oil	Sigma	M5310
MiniPrep Kit	Gene Choice	96-308
Mini-PROTEAN TGX Precast Gels 12 well	Bio-Rad	4561085
Molecular Biology Grade Water	Corning	46-000-CV
Multiband Polychroic Mirror	89903BS	Chroma
NaCl	Fisher Chemical	S271-3
PBS w/o Ca and Mg	Corning	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			Gift from Dr. Channing Der's Lab, UNC
PCR Tubes	labForce	1149Z65	0.2 mL 8-Strip Tubes and Caps, Rigid Strip Individually Attached Dome Caps
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 Patterned Illuminator	Mightex	DSI-G-00C
Primers	IDT
PVDF Membranes	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF/Filter Paper Sandwiches
T0.25% Trypsin, 2.21 mM, eDTA, 1x [-] sodium	Corning	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	Fischer	BP1332-1	For electrophoresis
UPlanSApo 40x Microscope Objective	Olympus	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	For TTL interface
β-Mercaptoethanol	Fisher Chemical	O3446I-100