Modèle de co-culture utilisant deux types de lignées cellulaires adhérentes

Résumé

Le protocole présente un nouveau modèle expérimental in vitro capable de récapituler la biologie de deux types de lignées cellulaires adhérentes avec un échafaudage imprimé en trois dimensions (3D). La construction de ce modèle et les procédures opératoires, de la préparation et de la culture cellulaires à l’analyse et à l’évaluation, sont décrites.

Résumé

L’implantation de l’embryon est affectée par les interactions entre les différents types de cellules dans l’interface mère-embryon. Les communications directes et indirectes entre les différents types de cellules au sein de la décidue sont cruciales pour réguler la réceptivité de l’endomètre ; Cependant, les mécanismes moléculaires qui interviennent dans cette interaction ne sont pas encore clairs. À cet égard, un modèle d’étude du processus d’implantation est nécessaire pour établir un modèle in vitro complet capable de récapituler la biologie de l’interaction épithélium-stroma de l’endomètre. Ce modèle est composé de plaques de culture cellulaire régulières et d’un échafaudage correspondant, qui est généré par impression tridimensionnelle (3D) à partir de matériaux à faible coût. Ici, nous détaillons un ensemble de protocoles pour la construction de modèles, la préparation cellulaire, l’ensemencement cellulaire, la culture cellulaire, l’observation et l’évaluation. De plus, nous avons inclus des résultats représentatifs avec des cellules présentant de bonnes conditions de croissance au microscope. Cette étude visait à développer des modèles in vitro qui imiteraient l’interaction entre les cellules stromales de l’endomètre et les cellules épithéliales, ainsi qu’entre les cellules trophoblastiques et les cellules endométriales.

Introduction

Malgré des recherches approfondies sur la grossesse humaine, les mécanismes moléculaires à l’interface mère-fœtus lors de l’implantation et au début de la grossesse restent mal compris¹. L’endomètre humain est principalement composé de deux types de cellules : les cellules épithéliales de l’endomètre (EEC) et les cellules stromales de l’endomètre (ESC). L’implantation progresse en trois étapes : l’apposition, l’attachement et l’invasion, qui conduisent au développement d’un embryon compétent et d’un endomètre^{réceptif 2}. Compte tenu des contraintes éthiques des études in vivo sur des sujets humains, ainsi que des difficultés à simuler complètement la condition humaine chez l’animal, la construction de modèles de culture d’endomètre humain in vitro est devenue un moyen efficace de reproduire les processus d’implantation et de grossesse^{précoce 3}. Ces modèles sont précieux pour l’étude des grossesses normales et pathologiques et fournissent une plate-forme fondamentale pour les essais préliminaires et la validation des interventions thérapeutiques en médecine translationnelle.

Les chambres commerciales ont été largement utilisées dans la recherche en biologie cellulaire. Ces chambres offrent des informations précieuses sur la migration cellulaire et l’interaction entre les différents types de cellules. Cependant, les chambres commerciales sont généralement à usage unique et peuvent être coûteuses⁴.

Un grand nombre de modèles de culture humaine in vitro composés d’endomètre et de blastocyste, ou de substituts de blastocyste, ont été développés pour mieux comprendre le processus détaillé d’implantation. Ces modèles, cependant, en sont encore à leur stade initial d’application car la structure 3D est un dispositif expérimental très compliqué, et certains supports de différenciation spécifiques sont coûteux ^5,6,7.

L’utilisation de matériel d’impression 3D abordable et une période de fabrication relativement courte permettent d’ajuster les structures pour cibler différentes fins expérimentales. Les techniques d’impression 3D permettent de réduire les coûts de temps et de créer des structures complexes et personnalisées. Cette technologie accélère considérablement la conception et l’itération des prototypes, ce qui en fait un outil précieux pour les chercheurs de divers domaines, leur permettant de mener à bien leur travail plus efficacement ^8,9,10.

Ici, nous présentons un protocole expérimental réalisable et économique pour la construction de la structure 3D et son utilisation comme système de culture cellulaire, qui peut simuler l’interaction entre les cellules stromales et épithéliales de l’endomètre pour l’étude de la réceptivité de l’endomètre lors de l’implantation de l’embryon. Il s’agit d’une alternative personnalisable et peu coûteuse aux matériaux jetables commerciaux.

Protocole

REMARQUE : Tous les réactifs utilisés dans ce protocole se trouvent dans la Table des matériaux. Sauf indication contraire, tous les fluides ont été pré-équilibrés à 37 °C avant utilisation.

1. 3D’impression de l’échafaudage et de la construction du modèle

REMARQUE : Les étapes ici ont été effectuées conformément au manuel de la machine d’impression 3D métal commerciale. Les étapes sont brièvement décrites ci-dessous (Fichier supplémentaire 1).

1. Imprimer la mise à niveau du lit
   1. Appuyez sur l’icône Menu sur le tableau de bord et accédez à Utilitaires. Sélectionnez Niveau du lit pour lancer la routine de mise à niveau.
   2. Retirez la feuille d’impression du lit d’impression et sélectionnez Terminé. Le lit d’impression montera à sa hauteur maximale en préparation du nivellement. Une fois que la barre de progression atteint 100 %, appuyez sur Démarrer.
   3. Si l’imprimante Metal X n’a pas été mise à niveau auparavant, sélectionnez Réinitialiser. Si c’est le cas, choisissez Skip (Ignorer ) et passez directement à l’étape 1.1.5 (balayage en 16 points).
   4. À l’aide d’une clé hexagonale de 2,5 mm, tournez toutes les vis de nivellement à trois lits dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce qu’elles soient bien serrées. Ensuite, desserrez-les en tournant deux rotations complètes dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour les régler à une hauteur médiane. Appuyez sur Terminé pour continuer.
   5. L’imprimante scannera le lit à 16 points désignés. Évitez de toucher le lit ou le cadre pendant ce processus. Une fois que la progression atteint 100 %, appuyez sur Suivant.
2. Application de feuille d’impression
   1. Retirez tout débris de métal ou de support résiduel. Basculez le curseur Aspirateur sur Activé.
   2. Laissez le lit s’abaisser et se réchauffer, puis appuyez sur Suivant. Placez la feuille d’impression sur la grille d’aspiration et appuyez sur Suivant.
   3. Placez la presse à feuilles sur la feuille d’impression, en l’alignant avec les rails en Z à l’arrière de la chambre.
   4. Attendez que le vide s’engage et créez un joint stable. Une fois l’aspirateur engagé, appuyez sur Terminé.
3. Chargement des filaments métalliques
   1. Positionnez manuellement la tête d’impression au centre de la zone d’impression. Retirez le couvercle de la tête d’impression en le faisant glisser vers le haut et en le décollant des vis de montage.
   2. Appuyez sur l’icône Menu sur le tableau des options. Sélectionnez Matériaux dans les options.
   3. Choisissez Charger Metal pour démarrer la routine de chargement. Choisissez Chargement rapide.
   4. Sélectionnez le type spécifique de matériau métallique à charger (par exemple, aluminium 6061-T6 | 3.3211 | 65028 | AlMg1SiCu).
   5. Placez la bobine sur le support et appuyez sur Suivant. Fermez la porte et laissez les bobines se réchauffer, puis appuyez sur Suivant.
   6. Insérez le matériau dans l’entrée avant de la tête d’impression (étiquetée M) jusqu’à ce que l’extrudeur commence à l’aspirer.
4. Impression de pièces métalliques
   1. Dans le panneau Paramètres d’impression, cliquez sur Exporter le bâtiment. Enregistrez le fichier sur une clé USB formatée en FAT32 et insérez-le dans l’imprimante.
   2. Sélectionnez l’icône Menu sur le tableau. Accédez à Stockage et sélectionnez Imprimer à partir du stockage. Choisissez le fichier pièce pour commencer l’impression.
5. Enlèvement de pièces métalliques
   1. Faites glisser avec précaution la feuille d’impression et les pièces imprimées hors du lit d’impression. Détachez délicatement les pièces de la feuille d’impression. La feuille flexible doit se décoller facilement.

2. Préparation à la co-culture cellulaire dans le modèle 3D

REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des matériaux résistants aux hautes températures comme consommables pour l’impression 3D, des supports d’échafaudage de lamelles de cellule afin de faciliter la stérilisation en autoclave avant chaque utilisation dans des expériences de culture cellulaire. Des cellules stromales de l’endomètre humain immortalisées (HESC) et des cellules épithéliales de l’endomètre humain (Ishikawa) ont été utilisées dans cette étude. La caractérisation de ces lignées cellulaires a déjà été rapportée ^5,6.

1. Culture cellulaire et passage
   1. Préparez 50 ml de milieu complémentaire pour les CSEh en ajoutant du milieu DMEM/F12 + 2 mM de L-Glutamine + 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) décapé de charbon de bois + 1 % de solution de pénicilline/streptomycine.
   2. Préparez 50 ml de milieu complémentaire pour Ishikawa en ajoutant le milieu Eagle modifié de Dulbecco + 10 % de FBS + 1 % de solution de pénicilline/streptomycine.
   3. Décongélation cellulaire
      REMARQUE : La lignée cellulaire achetée a été expédiée sur de la glace sèche à l’état congelé. Il doit être stocké en phase vapeur d’azote liquide ou à une température inférieure à -130 °C.
      1. Préparez tout le matériel stérilisé et l’enzyme de dissociation nécessaires, et réchauffez le milieu complémentaire à 37 °C.
      2. Décongelez rapidement les cellules dans un bain d’eau à 37 °C avec un léger balancement occasionnel. Transvaser la suspension cellulaire dans un tube contenant 5 mL de milieu de culture basal et centrifuger à 200 x g pendant 5 min.
      3. Retirez délicatement le surnageant. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de milieu de culture complet préparé et la distribuer dans deux flacons de culture T25. Cultivez les cellules dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂.
2. Préparation des cellules à l’aide d’une lamelle
   1. Utilisez une lamelle carrée de 18 mm comme surface de la culture cellulaire ; Assurez-vous que la lamelle est propre et stérile.
   2. Enduisez la lamelle au fond d’une plaque à 12 puits avec 200 μL de matrice extracellulaire (MEC) à une concentration de 200 à 300 μg/mL. Maintenez la plaque à 37 °C pendant 1 h.
   3. Retirez l’ECM de la plaque. Inspectez les cellules pour une confluence appropriée et assurez-vous que la densité des deux lignées cellulaires est d’environ 70 à 80 %
   4. Retirez le milieu épuisé et lavez les cellules avec 3 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 2x.
   5. Ajouter 2 mL d’enzyme de dissociation et cultiver les cellules à 37 °C pendant 2 min pour les détacher.
   6. Neutraliser avec un milieu de culture complet et créer une suspension unicellulaire en pipetant de haut en bas.
   7. Prélever 100 μL de suspension cellulaire et mélanger avec du bleu de trypan (facteur de dilution = 2).
   8. Faites glisser la lamelle sur la chambre de l’hémocytomètre. Remplissez les deux chambres latérales avec la suspension cellulaire contenant du bleu trypan.
   9. Comptez le nombre de cellules en carrés des deux côtés à l’aide d’un microscope 20x et calculez la densité des cellules.
   10. Transférez les cellules dans la plaque préparée avec un milieu frais et incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂. Semez dans le puits à raison de 1 x 10⁵ cellules/mL pendant 24 h.
   11. Pour la lignée cellulaire Ishikawa, ensemencez la cellule dans le puits sans lamelle le lendemain.

3. Montage du modèle de co-culture

1. Trempez soigneusement les échafaudages avec de l’alcool éthylique et de l’eau doublement distillée (ddw) pendant 2 jours. Stérilisez les échafaudages à l’aide d’un autoclave à 121 °C et séchez-les.
2. Ajouter environ 2 mL de milieu complémentaire pour la lignée cellulaire d’Ishikawa à l’Ishikawa en bonne culture, en s’assurant que le niveau de liquide recouvre la lamelle.
3. Transférez le couvercle avec hESC sur l’échafaudage et maintenez le côté avec la cellule vers le bas. Branchez l’échafaudage dans l’Ishikawa bien cultivé. Pour la deuxième série, inversez cette disposition en transférant la couverture de lamelle avec Ishikawa sur l’échafaudage et en branchant l’échafaudage dans le hESC de bonne culture. Utilisez les cellules sans la configuration d’échafaudage pour une analyse de croissance cellulaire en croissance indépendante.
4. Incuber le système de co-culture à 37 °C, 5 % CO₂. La période de co-culture peut varier en fonction de la conception expérimentale, mais elle varie généralement de 24 à 72 h.

4. Acquisition d’images

1. Retirez délicatement le milieu de culture et rincez doucement les cellules avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
2. Retirez les lamelles avec les cellules attachées des boîtes de culture à l’aide d’une pince fine ou d’une pince à épiler. En option, placez les lamelles dans un nouveau plat avec du PBS pour éviter le dessèchement pendant le transfert.
3. Prenez une lame de microscope propre et placez une goutte de PBS. Transférez doucement la lamelle contenant les cellules sur la goutte du support de montage, en vous assurant que les cellules sont orientées vers le bas sur la lame.
4. Placez la lame préparée sur la platine du microscope inversé. Sélectionnez l’objectif approprié (par exemple, 10x, 20x) et ajustez la mise au point à l’aide de boutons de mise au point grossiers et fins.
5. Réglez les paramètres du microscope tels que l’intensité de l’éclairage et les paramètres de la caméra. À l’aide du logiciel du microscope, capturez des images des cellules aux grossissements et aux champs de vision souhaités. Ajustez le temps d’exposition et d’autres paramètres d’imagerie pour optimiser la qualité de l’image.

5. Traitement d’image

1. Cliquez sur Ouvrir pour ouvrir l’image, cliquez sur Traiter > filtres > Amélioration afin > choisir Égalisation locale, puis cliquez sur Appliquer.
2. Cliquez sur Modifier > Convertir en > Échelle de gris 8. Cliquez sur Améliorer, choisissez Appliquer le contraste.
3. Cliquez sur Compter et mesurer les sujets. Cliquez sur Manuel, sélectionnez une plage et ajustez l’histogramme pour vous assurer que toutes les cellules sont couvertes.
4. Cliquez sur Appliquer un masque, fermez la fenêtre active, cliquez sur Objets lumineux automatiques > mesurer, sélectionnez Mesure, puis choisissez Aera, Dendric, Density et Size.
5. Cliquez sur Objets lumineux automatiques, puis sur Compter. Cliquez sur Exporter les données pour exporter les données de mesure dans une feuille de calcul.

6. Prélèvement cellulaire

1. Retirez les lamelles de la lame de microscope et transférez-les dans un puits propre et sec.
2. Récoltez la cellule d’Ishikawa avec le réactif d’isolement de l’ARN pour la recherche transcriptomique ou le réactif de lyse Ripa pour la recherche protéomique.
   REMARQUE : Pour les CSEh, la méthode de culture sur lamelles s’est avérée plus efficace pour la capture d’images après coloration immunitaire. Alternativement, la CSEh pourrait être récoltée avec un réactif d’isolement d’ARN ou un réactif de lyse Ripa. Les lignées cellulaires cultivées sur la lamelle ou à la surface de la plaque ont pu être échangées ; Cependant, nous recommandons que les cellules préparées pour l’analyse d’imagerie soient ensemencées sur la lamelle.

Résultats

La figure 1 montre l’échafaudage fait maison pour les lames de cellules utilisé dans ce processus, qui comprend un anneau de support supérieur conçu pour être fixé à des plaques de culture cellulaire standard à 12 puits, complété par un support de lame de cellule basale doté de quatre structures en forme de tige en forme de L.

Selon la figure 2, la densité des deux types de cellules dans...

Discussion

Un protocole simplifié et rentable est décrit pour la co-culture indirecte de cellules stromales et épithéliales de l’endomètre. Cette méthode utilise un échafaudage fait maison pour les lames de cellules, qui comprend un anneau de support supérieur conçu pour la fixation à des plaques de culture cellulaire standard à 12 puits, complété par un support de lame de cellule basale doté de quatre structures en forme de tige en forme de L. Cette configuration facilite la sépar...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hanks′ Balanced Salt solution	Solarbio	H1046	1/10
12-well Clear TC-treated Plates	Corning	3513	-
25 cm² Cell Culture Flask	Corning	430639	-
Aluminum	Markforged	6061-T6	-
DMEM/F12	Sigma-aldrich	D2906	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
FBS	Gibco	10099141C	1/10
Fetal bovine serum	Gibco	10099141C
ITS Premix	Biocoat	354350	1/100
Matrigel Matrix	Corning	354248	ECM
Metal X	Markforged	M F-PR-5000	-
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	1/100
Round Coverslip	Biosharp	BS-18-RC	-
TrypLE Select (10X)	Gibco	A1217701	dissociation enzyme