Interférence de l’ARN larvaire chez le ver à soie Bombyx mori par l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb

Résumé

Voici un protocole pour l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb dans les larves de ver à soie Bombyx mori afin d’induire le silençage génique par ingestion.

Résumé

Le ver à soie, Bombyx mori, est un insecte économique important avec des milliers d’années d’histoire en Chine. Pendant ce temps, le ver à soie est l’insecte modèle des Lépidoptères avec une bonne accumulation de recherche fondamentale. C’est également le premier insecte chez les lépidoptères dont le génome complet a été séquencé et assemblé, ce qui fournit une base solide pour l’étude de la fonction génétique. Bien que l’interférence ARN (ARNi) soit largement utilisée dans l’étude fonctionnelle des gènes inverses, elle est réfractaire chez les vers à soie et d’autres espèces de lépidoptères. Des recherches antérieures réussies sur l’ARNi pour délivrer de l’ARN double brin (ARNdb) ont été réalisées par injection uniquement. L’administration d’ARNdb par l’alimentation n’est jamais rapportée. Dans cet article, nous décrivons les procédures étape par étape pour préparer les nanoparticules de chitosane/ARNdb, qui sont données aux larves de ver à soie par ingestion. Le protocole comprend (i) la sélection du stade approprié des larves de vers à soie, (ii) la synthèse de l’ARNdb, (iii) la préparation des nanoparticules de chitosane/ARNdb, et (iv) l’alimentation des larves de vers à soie avec des nanoparticules de chitosane/ARNdb. Des résultats représentatifs, y compris la confirmation du transcrit du gène et l’observation du phénotype, sont présentés. L’alimentation par ARNdb est une technique simple pour l’ARNi chez les larves de vers à soie. Étant donné que les larves de vers à soie sont faciles à élever et assez grandes pour être utilisées, il s’agit d’un bon modèle pour démontrer l’ARNi larvaire chez les insectes. De plus, la simplicité de cette technique stimule une plus grande implication des étudiants dans la recherche, ce qui fait des larves de vers à soie un système génétique idéal pour une utilisation en classe.

Introduction

Le ver à soie, Bombyx mori, est un insecte domestiqué il y a plus de 5000 ans en Chine. En raison de sa capacité à produire de la soie, le ver à soie est un insecte économique important dans l’agriculture et la sériciculture chinoises. Le ver à soie est le deuxième insecte modèle après la mouche des fruits. En tant qu’insecte modèle chez les lépidoptères, le ver à soie est facile à élever, avec une grande taille et de nombreux mutants. Pendant ce temps, le ver à soie est le premier insecte lépidoptère dont le génome complet a été séquencé¹. De nombreuses bases de données fournissant des informations su....

Protocole

1. Espèces de vers à soie et élevage

1. Élevez au moins 120 larves de vers à soie du^1er stade fraîchement écloses de la souche B. mori P50 avec des feuilles de mûrier fraîches à 25 ± 1 °C, photopériode 12 h Lumière :12 h Foncé et 75% ± 5% d’humidité relative.

2. Sélection des larves de vers à soie

1. Choisissez le jour 1 des larves du 5^e stade pour l’expérience ARNi ; Les larves de vers à soie grandissent rapidement après le 3e jour du 5^e stade, ce qui est idéal pour comparer les différences d’apparence des larve....

Discussion

Un stade approprié est important pour l’observation du phénotype de l’ARNi, en fonction des gènes ciblés. Nos résultats préliminaires ont montré que Toll9-2 est impliqué dans la croissance du ver à soie. La taille et le poids des larves de vers à soie augmentent rapidement au 5^e stade²¹. Par conséquent, les larves du 5e stade sont sélectionnées comme scène pour l’expérience d’alimentation en nanoparticules de chitosane/AR.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles