Interférence de l’ARN larvaire chez le ver à soie Bombyx mori par l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb

Résumé

Voici un protocole pour l’administration de nanoparticules de chitosane/ARNdb dans les larves de ver à soie Bombyx mori afin d’induire le silençage génique par ingestion.

Résumé

Le ver à soie, Bombyx mori, est un insecte économique important avec des milliers d’années d’histoire en Chine. Pendant ce temps, le ver à soie est l’insecte modèle des Lépidoptères avec une bonne accumulation de recherche fondamentale. C’est également le premier insecte chez les lépidoptères dont le génome complet a été séquencé et assemblé, ce qui fournit une base solide pour l’étude de la fonction génétique. Bien que l’interférence ARN (ARNi) soit largement utilisée dans l’étude fonctionnelle des gènes inverses, elle est réfractaire chez les vers à soie et d’autres espèces de lépidoptères. Des recherches antérieures réussies sur l’ARNi pour délivrer de l’ARN double brin (ARNdb) ont été réalisées par injection uniquement. L’administration d’ARNdb par l’alimentation n’est jamais rapportée. Dans cet article, nous décrivons les procédures étape par étape pour préparer les nanoparticules de chitosane/ARNdb, qui sont données aux larves de ver à soie par ingestion. Le protocole comprend (i) la sélection du stade approprié des larves de vers à soie, (ii) la synthèse de l’ARNdb, (iii) la préparation des nanoparticules de chitosane/ARNdb, et (iv) l’alimentation des larves de vers à soie avec des nanoparticules de chitosane/ARNdb. Des résultats représentatifs, y compris la confirmation du transcrit du gène et l’observation du phénotype, sont présentés. L’alimentation par ARNdb est une technique simple pour l’ARNi chez les larves de vers à soie. Étant donné que les larves de vers à soie sont faciles à élever et assez grandes pour être utilisées, il s’agit d’un bon modèle pour démontrer l’ARNi larvaire chez les insectes. De plus, la simplicité de cette technique stimule une plus grande implication des étudiants dans la recherche, ce qui fait des larves de vers à soie un système génétique idéal pour une utilisation en classe.

Introduction

Le ver à soie, Bombyx mori, est un insecte domestiqué il y a plus de 5000 ans en Chine. En raison de sa capacité à produire de la soie, le ver à soie est un insecte économique important dans l’agriculture et la sériciculture chinoises. Le ver à soie est le deuxième insecte modèle après la mouche des fruits. En tant qu’insecte modèle chez les lépidoptères, le ver à soie est facile à élever, avec une grande taille et de nombreux mutants. Pendant ce temps, le ver à soie est le premier insecte lépidoptère dont le génome complet a été séquencé¹. De nombreuses bases de données fournissant des informations sur le génome², le transcriptome³, l’étiquette de séquence exprimée (EST)⁴, l’ARN non codant⁵ et le microsatellite⁶ sont également accessibles au public. Les faits ci-dessus font du ver à soie un modèle parfait pour la recherche génétique.

L’interférence ARN (ARNi) est un processus cellulaire dans lequel les molécules d’ARN double brin (ARNdb) se lient et tranchent l’ARN messager complémentaire (ARNm), obtenant ainsi l’effet de silençage du gène cible. Ce mécanisme est naturellement présent chez les bactéries pour se défendre contre l’invasion des virus⁷. Plus tard, il a été découvert que l’ARNi est conservé chez les animaux, les plantes et les microbes. En raison de son puissant effet de silençage spécifique à la séquence, l’ARNi est utilisé dans la recherche fondamentale pour manipuler l’expression des gènes et étudier la fonction des gènes. L’ARNi est obtenu par l’administration d’ARNdb dans les cellules.

Chez les insectes, il existe trois façons courantes d’administrer l’ARNdb, à savoir la microinjection, l’alimentation et le trempage⁸. À l’heure actuelle, les rapports réussis d’ARNi dans les vers à soie par l’administration d’ARNdb nu sont effectués par injection d’ARNdb⁹. Les avantages de la micro-injection sont l’administration immédiate de l’ARNdb dans l’hémolymphe et le contrôle précis de la quantité d’ARNdb. Cependant, certains inconvénients de la micro-injection existent également. Par exemple, cela prend du temps et nécessite des appareils délicats. Il est également important d’optimiser les aiguilles d’injection, le volume d’injection et la quantité d’ARNdb. Par conséquent, une autre façon de transmettre l’ARNdb aux vers à soie devient nécessaire. Parce que l’exosquelette d’un insecte est une barrière étanche faite de chitine, le trempage des larves d’insectes pour obtenir de l’ARNi est rarement signalé, ce qui n’est pas une bonne option pour l’ARNi chez les insectes. L’alimentation en ARNdb est économique en main-d’œuvre, rentable et facile à réaliser¹⁰. Cette méthode est également applicable pour le criblage de gènes à haut débit¹¹. Cependant, il a été constaté qu’une nucléase non spécifique de l’ADN/ARN, à savoir la BmdsRNase, est présente dans l’intestin moyen et le jus de l’intestin moyen des larves de ver à soie¹². Il est démontré que cette nucléase digère l’ARNdb, de préférence¹³. Par conséquent, il semble difficile de donner de l’ARNdb nu au ver à soie pour réduire au silence l’expression des gènes.

Récemment, l’ARNdb protégé par des nanoparticules s’est avéré être une bonne alternative pour augmenter l’efficacité de l’ARNi en nourrissant¹⁴. Le chitosane est un polymère peu coûteux, non toxique et biodégradable, qui peut être préparé par désacétylation de la chitine, un biopolymère naturel et le deuxième biopolymère le plus abondant après la cellulose¹⁵. Parce que le groupe amino dans le chitosane est chargé positivement et que le groupe phosphate sur le squelette de l’ARNdb est chargé négativement, les nanoparticules de chitosane/ARNdb pourraient être formées par auto-assemblage de polycations¹⁶. Les nanoparticules de chitosane/ARNdb sont efficaces pour obtenir de l’ARNi par l’alimentation des larves chez les moustiques Aedes aegypti et Anopheles gambiae¹⁷, le ver de la capsule à taches de coton Earias vittella¹⁸ et l’araignée carmin Tetranychus cinnabarinus¹⁹.

Afin de développer une méthodologie pour l’administration de l’ARNdb en se nourrissant des vers à soie pour obtenir une efficacité réussie de l’ARNi, ce rapport se concentre sur la description des procédures étape par étape sur la façon de préparer les nanoparticules de chitosan/ARNdb et de nourrir les larves de vers à soie avec les nanoparticules. Cette méthodologie est relativement peu coûteuse, économique en main-d’œuvre et facile à suivre, qui peut être adaptée pour des études de silençage génique chez d’autres insectes. Notre objectif est de fournir un protocole plus facile pour la méthode d’administration de l’ARNdb des lépidoptères avec une efficacité ARNi plus élevée.

Protocole

1. Espèces de vers à soie et élevage

1. Élevez au moins 120 larves de vers à soie du^1er stade fraîchement écloses de la souche B. mori P50 avec des feuilles de mûrier fraîches à 25 ± 1 °C, photopériode 12 h Lumière :12 h Foncé et 75% ± 5% d’humidité relative.

2. Sélection des larves de vers à soie

1. Choisissez le jour 1 des larves du 5^e stade pour l’expérience ARNi ; Les larves de vers à soie grandissent rapidement après le 3e jour du 5^e stade, ce qui est idéal pour comparer les différences d’apparence des larves.
   REMARQUE : Alternativement, des stades plus jeunes, tels que le 3^e ou le 4^e stade, pourraient être utilisés pour l’expérience ARNi. Cependant, il nécessite un traitement constant à l’ARNdb jusqu’au 5^e stade, ce qui est relativement coûteux et coûte en matériaux.

3. Synthèse de l’ARNdb

1. Identification du fragment cible de l’ARNdb : Sélectionnez la séquence codante d’un gène cible et alignez-la avec d’autres gènes homologues pour déterminer la région conservée. Concevoir des amorces spécifiques au gène dans la région non conservée pour l’amplification ultérieure du fragment cible de l’ARNdb. Pour les expériences sur l’ARNi chez les insectes, le fragment cible typique de l’ARNdb est généralement de 400 à 600 pb. La taille minimale pourrait être de 200 pb.
   REMARQUE : Pour améliorer l’efficacité et le taux de réussite des expériences ARNi, un outil Web peut être utilisé pour concevoir la cible d’ARNdb, tel que dsRNA Engineer (https://dsrna-engineer.cn/).
2. Production d’un modèle de produit PCR : Ajouter un promoteur d’ARN polymérase T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') à l’extrémité 5' de l’une ou l’autre des amorces conçues ci-dessus. Effectuez une PCR standard pour amplifier le fragment cible de l’ARNdb. Exécutez un gel d’agarose à 1 % dans 1x TAE pour vérifier un seul produit PCR de la taille attendue. Après cela, purifiez le produit PCR avec un kit de purification (Table des matériaux) et utilisez-le pour la transcription ultérieure.
   REMARQUE : Pour conserver le produit PCR cible à long terme et obtenir des rendements élevés, il est suggéré de ligaturer le produit PCR à un plasmide. Le plasmide doit être linéarisé avant la réaction PCR.
3. Génération d’ARNdb : Utilisez un système d’ARNi T7 (Table des matériaux) pour générer l’ARNdb. Configurez la réaction en ajoutant les composants à température ambiante selon les instructions du fabricant. Mélanger la réaction par pipetage doux et incuber à 37 °C pendant 30 min.
   REMARQUE : Pour maximiser le rendement, l’incubation à 37 °C peut être prolongée jusqu’à 2-6 h. Pour les matrices contenant une structure secondaire ou riche en GC, l’incubation peut être effectuée à 42 °C à la place pour améliorer le rendement en ARNdb.
4. Recuit pour former l’ARNdb : Incuber la réaction à 70 °C pendant 10 min, puis refroidir lentement à température ambiante (~20 min). Cela permettra de recuire l’ARNdb.
5. Traitement de la DNase et de la RNase : Pipeter 1 μL de la solution de RNase fournie à 199 μL d’eau sans nucléase pour obtenir une solution de RNase fraîchement diluée. Ajouter 1 μL de solution de RNase fraîchement diluée et 1 μL de DNase sans RNase RQ1 fournie par volume de réaction de 20 μL, mélanger doucement et incuber à 37 °C pendant 30 min. L’ARN simple brin (ARNss) et l’ADN matrice de la réaction seront éliminés après ce traitement.
6. Précipitation d’alcool : Ajouter 1 volume d’isopropanol ou 2,5 volumes d’éthanol à 95 % ainsi que 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2) à la réaction. Mélanger la réaction par vortex et incuber sur glace pendant 5 min pour former une masse trouble. Faites tourner à vitesse maximale dans une centrifugeuse pendant 10 min pour recueillir une pastille blanche au fond du tube. Jetez le surnageant et lavez la pastille avec 0,5 mL d’éthanol froid à 70 % pour éliminer le sel résiduel. Retirez l’éthanol après le lavage. Laissez le granulé sécher à l’air libre à température ambiante pendant 15 min. Remettez le granulé en suspension avec de l’eau sans nucléase dans 2 à 5 fois le volume de réaction initial. Conserver à -20 °C ou -70 °C.
   REMARQUE : La pastille d’ARNdb ne doit pas être trop sèche, car cela pourrait rendre difficile la remise en suspension complète. Pour assurer une remise en suspension suffisante, un minimum de 2 volumes est nécessaire.
7. Contrôle de la quantité et de la qualité de l’ARNdb : Diluer l’ARNdb dans de l’eau exempte de nucléases dans un rapport de 1:100 à 1:300. Déterminer la concentration d’ARNdb à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume (Table des matériaux) selon les instructions du fabricant. Pour quantifier l’ARNdb, multipliez la concentration par le volume. Pour évaluer la qualité de l’ARNdb, utilisez l’électrophorèse sur gel d’agarose. Préparez un gel d’agarose à 1 % en 1x TAE et diluez l’ARNdb à 1:50 avec de l’eau sans nucléases. Utiliser 5 μL d’ARNdb dilué par voie et colorer le gel avec 0,5 mg/mL de bromure d’éthidium pendant au moins 15 min pour la visualisation.
   REMARQUE : L’ARNdb migre plus lentement que l’ADNdb.

4. Préparation des nanoparticules de chitosane/ARNdb

1. Faire tamponner 100 mM d’acétate de sodium (0,1 M de NaC₂H₃O₂ et 0,1 M d’acide acétique, pH 4,5 dans l’eau désionisée) et 100 mM de sulfate de sodium (100 mM de Na₂SO₄ dans l’eau désionisée) à température ambiante.
2. Dissoudre le chitosane commercialisé (provenant de carapaces de crevettes, désacétylé à ≥75 % ; Table des matériaux) dans un tampon d’acétate de sodium de 100 mM pour obtenir une solution de chitosane à 0,02 % (p/v).
3. Dissoudre 20 μg d’ARNdb dans 50 μL d’eau exempte de nucléases et l’ajouter à 50 μL de tampon de sulfate de sodium de 100 μL pour obtenir une solution de 100 μL d’ARNdb.
4. Ajouter 100 μL de solution de chitosane à 100 μL de solution d’ARNdb. En même temps, préparer un témoin en ajoutant 100 μL de solution de chitosane à 100 μL de sulfate de sodium 50 mM. Mélangez et faites chauffer les mélanges à 55 °C pendant 1 min.
5. Vortex le mélange immédiatement avec un vortex à grande vitesse pendant 30 s pour permettre la formation des nanoparticules.
6. Centrifuger le mélange à 13 000 x g à température ambiante pendant 10 min pour obtenir une pastille blanche. Transférez le surnageant dans un tube frais de 1,5 ml. Laissez sécher les granulés à l’air libre à température ambiante pendant 10 min.
7. Déterminer la concentration d’ARNdb dans le surnageant à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume (Tableau des matériaux). Utilisez le surnageant de la commande comme un blanc. Multipliez la concentration par le volume pour calculer la quantité totale d’ARNdb restante dans le surnageant. Calculez le pourcentage d’ARNdb encapsulé dans les nanoparticules par la quantité restante dans le surnageant divisée par la quantité de départ d’ARNdb.
   REMARQUE : Même si les nanoparticules peuvent être conservées à une température de 4 à 37 °C pendant au moins 15 jours avant d’être utilisées¹⁴, il est suggéré d’utiliser les nanoparticules dès que possible.

5. Nourrir les larves de vers à soie avec des nanoparticules de chitosane/ARNdb

1. Choisissez des larves de vers à soie du 5^e stade fraîchement muées (c.-à-d. le jour 1 du 5^e stade) de la même taille pour l’expérience d’alimentation. Placez les larves individuellement dans chaque puits d’une plaque à 6 puits avant de fermer le couvercle et de les laisser mourir de faim pendant 24 h.
2. Rincez les feuilles de mûrier fraîches avec de l’eau déminéralisée et séchez-les avec du papier absorbant propre. Les feuilles de mûrier doivent être sèches sans gouttes d’eau. Coupez en disques de feuilles de mûrier de 1 cm x 1 cm.
3. Dissoudre les nanoparticules de chitosane/ARNdb dans de l’eau exempte de nucléases à 500 ng/μL avant utilisation. Diluer les nanoparticules de chitosane de contrôle (préparées en 4.4) avec le même volume d’eau sans nucléases. Préparez l’ARNdb nu à 500 ng/μL dans de l’eau sans nucléase.
4. Utilisez les nanoparticules de chitosane/ARNdb pour l’expérience d’inactivation de l’ARNi, les nanoparticules de chitosane de contrôle comme contrôle blanc/négatif. Utilisez l’ARNdb nu pour comparer les différences avec les nanoparticules de chitosane/ARNdb.
5. Enduisez 10 μL de nanoparticules de chitosane/ARNdb, de chitosane et d’ARNdb nu à la surface de chaque disque foliaire, respectivement. Faites sécher à l’air libre la solution de nanoparticules et la solution d’ARNdb sur les disques foliaires à température ambiante pendant 5 min.
6. Nourrissez chaque larve avec un disque foliaire enrobé de nanoparticules ou d’ARNdb par jour. Fournir aux larves des disques foliaires enrobés de nanoparticules ou d’ARNdb en continu pendant 5 jours. Des feuilles de mûrier fraîches peuvent être fournies une fois que le disque foliaire recouvert est entièrement mangé par les larves chaque jour.
7. Le jour 6, anesthésie les larves sur de la glace jusqu’à ce qu’elles ne bougent plus et dissèque les larves pour l’échantillonnage. Coupez le thorax avec des ciseaux sur une boîte de Pétri propre. Retirez l’intestin moyen à l’aide d’une pince à épiler. Retirez le contenu de l’intestin moyen et lavez-le dans une autre boîte de Pétri remplie d’eau sans nucléases. Conservez l’intestin moyen dans un tube de 1,5 ml et conservez-le à -70 °C.

6. Confirmation du silençage génique

1. Effectuez une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) pour calculer la quantification relative du transcrit. Au moins trois répétitions biologiques et trois répétitions techniques sont requises pour chaque répétition. Au moins deux gènes de référence sont recommandés pour normaliser le transcrit relatif. Un gène Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2) est testé. Évaluez l’efficacité du silençage génique en comparant la valeur moyenne du transcrit relatif au groupe témoin et convertissez-la en pourcentage.
   REMARQUE : La condition d’amplification de la qRT-PCR, les informations sur l’amorce et le calcul de la transcription relative se trouvent dans notre récente publication²⁰.
2. Analysez le phénotype de l’ARNi pour évaluer l’effet de silençage génique. Observez la taille des larves et des cocons. Prenez des photos tous les jours pour enregistrer les apparitions.
   REMARQUE : L’ARNi peut affecter la morphologie, la métamorphose, la physiologie et le comportement. L’observation des phénotypes liés à l’ARNi dépend des gènes ciblés.

Résultats

Pour évaluer l’efficacité de l’ARNi, un gène immunitaire ciblant BmToll9-2 a été choisi pour l’analyse. Le gène BmToll9-2 est bien caractérisé en laboratoire, et le silençage génique par injection d’ARNdb permet d’obtenir des larves plus légères et plus petites dans notre récente publication²⁰. Pour confirmer l’efficacité de l’ARNi par ingestion à travers des nanoparticules de chitosane/ARNdb, des nanoparticules de ch...

Discussion

Un stade approprié est important pour l’observation du phénotype de l’ARNi, en fonction des gènes ciblés. Nos résultats préliminaires ont montré que Toll9-2 est impliqué dans la croissance du ver à soie. La taille et le poids des larves de vers à soie augmentent rapidement au 5^e stade²¹. Par conséquent, les larves du 5e stade sont sélectionnées comme scène pour l’expérience d’alimentation en nanoparticules de chitosane/AR...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	Sangon	F601620	for dsRNA or nanoparticles reaction
10 μl pipette	Eppendorf	P13473G	to aspirate or resuspend liquid
100 μl pipette	Eppendorf	Q12115G	to aspirate or resuspend liquid
2.5 μl pipette	Eppendorf	P20777G	to aspirate or resuspend liquid
20 μl pipette	Eppendorf	H19229E	to aspirate or resuspend liquid
200 μl pipette	Eppendorf	H20588E	to aspirate or resuspend liquid
6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates	Costar	3516	for silkworm rearing individually
Acetic acid	Aladdin	A116165	to make TAE
Agarose M	BBI Life Sciences	A610013	for agarose gel electrophosis
Analytical balance	Sartorius	BSA224S	to weight ingredients
Centrifuge	Sartorius	Centrisart A-14C	to centrifuge to form dsRNA or nanoparticles
Chitosan	Sigma-Aldrich	C3646	to combine with dsRNA for preparation of nanoparticles
EDTA	Sangon	A500895	to make TAE
Ethanol	Aladdin	E130059	to make TAE, or for dsRNA precipitation
Freezer	Siemens	iQ300	to store dsRNA or nanoparticles
GoTaq Green Master Mix	Promega	M712	for PCR reaction
GoTaq qPCR Master Mix	Promega	A6002	for qRT-PCR reaction
Isopropanol	Aladdin	I112011	for dsRNA precipitation
NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher	One	to determine the concentration of dsRNA
ph meter	Sartorius	PB-10	to prepare buffers
SanPrep Column PCR Product Purification Kit	Sangon	B518141	for PCR product purification
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	to make 100 mM sodium acetate buffer
Sodium sulfate	Sigma-Aldrich	239313	to make 100 mM sodium sulfate buffer
T7 RiboMAX Express RNAi System	Promega	P1700	for dsRNA synthesis
ThermoMixer	Eppendorf	C	for dsRNA generation or nanoparticles heating
Tris	Sangon	A501492	to make TAE
Vortex	IKA	Vortex 3	to prepare chitosan/dsRNA nanoparticles