Exploiter la puissance des cargaisons de microARN dans de petites vésicules extracellulaires libérées par des sections de cerveau humain fraîchement congelées

Résumé

Ici, nous établissons un protocole utilisant des quantités minimales de coupes de tissu cérébral fraîchement congelé et une méthode de centrifugation à grande vitesse accessible couplée à une chromatographie d’exclusion stérique pour obtenir de petites vésicules extracellulaires comme sources de biomarqueurs de microARN (miARN) pour les troubles neurologiques.

Résumé

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des médiateurs cruciaux de la communication cellule-cellule, transportant diverses cargaisons comme les protéines, les lipides et les acides nucléiques (microARN, ARNm, ADN). La cargaison de microARN sEV a une utilité potentielle en tant que biomarqueur de maladie puissant et non invasif en raison de la capacité de sEV à traverser les barrières biologiques (par exemple, la barrière hémato-encéphalique) et à devenir accessible par divers fluides corporels. Malgré de nombreuses études sur les biomarqueurs de la sEV dans les fluides corporels, l’identification de sous-populations de sEV spécifiques aux tissus ou aux cellules reste difficile, en particulier à partir du cerveau. Notre étude relève ce défi en adaptant les méthodes existantes pour isoler les sEVs à partir de quantités minimales de sections de cerveau humain congelées à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique (SEC).

Après approbation éthique, environ 250 μg de tissu cérébral humain fraîchement congelé (obtenu de la Manchester Brain Bank [Royaume-Uni]) ont été tranchés à partir des 3 tissus du donneur et incubés dans une solution de collagénase de type 3/Hibernate-E, avec agitation intermédiaire, suivie d’étapes de centrifugation et de filtration en série. Ensuite, les sEVs ont été isolés à l’aide de la méthode SEC et caractérisés en suivant les directives MISEV. Avant d’isoler l’ARN à l’intérieur de ces sEV, la solution a été traitée avec de la protéinase-K et de la RNase-A pour éliminer tout ARN extracellulaire non sEV. La quantité et la qualité de l’ARN ont été vérifiées et traitées pour les expériences de qPCR et de séquençage de petits ARN.

La présence de sEVs a été confirmée par l’analyse de suivi des nanoparticules de fluorescence (fNTA) et le western blot pour les marqueurs de surface (CD9, CD63, CD81). La distribution granulométrique (50-200 nm) a été confirmée par NTA et microscopie électronique. La concentration totale d’ARN dans les sEV lysés variait de 3 à 9 ng/μL et a été utilisée pour la quantification réussie par qPCR de microARN candidats sélectionnés. Le séquençage de petits ARN sur MiSeq a fourni des données de haute qualité (Q >32) avec 1,4 à 5 millions de lectures par échantillon.

Cette méthode permet d’isoler et de caractériser efficacement les sEV à partir de volumes minimaux de tissu cérébral, facilitant la recherche non invasive de biomarqueurs, et est prometteuse pour des études équitables de biomarqueurs de maladies, offrant des informations sur les maladies neurodégénératives et potentiellement d’autres troubles.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont l’un des acteurs clés de la communication intercellulaire chez tous les organismes multicellulaires¹. Les VE sont des particules membranaires lipidiques bicouches dérivées de cellules qui peuvent faciliter le transfert d’une variété de charges, telles que des protéines, des lipides et des acides nucléiques, vers les cellules réceptrices. Les VE peuvent avoir une large gamme de tailles allant de 30 nm à 1 μM. Les petits VE (sEV), définis comme des vésicules liées aux lipides d’un diamètre moyen de <200 nm, ont la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique ; par conséquent, ils ont été impliqués dans la propagation et l’exacerbation de maladies neurodégénératives et d’autres affections telles que la maladie d’Alzheimer (MA), la démence frontotemporale (FTD), la maladie de Parkinson (MP) et les cancers ^2,3. De plus, comme les sEV peuvent être trouvés dans une gamme de biofluides tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien (LCR), la salive et même l’urine, leur utilisation bénéfique peut couvrir le domaine des biomarqueurs et des diagnostics non invasifs. Par exemple, la recherche sur la MA peut indiquer l’utilisation de rapports de protéines pathogènes de biofluides, tels que tau/Aβ, ou même Aβ₄₂/Aβ₄₀⁴.

L’une des cargaisons connues de sEV est le microARN (miARN), un groupe de petites molécules d’ARN non codantes d’environ 22 nucléotides de longueur qui se lient aux régions 3'-UTR de l’ARNm et régulent généralement négativement l’expression des protéines. Impliqués dans de nombreux rôles cellulaires, les miARN ont également été impliqués dans la pathogenèse de diverses maladies, notamment les cancers et les maladies neurodégénératives. Cheng et al. ont effectué une analyse de séquençage à haut débit des signatures d’expression des miARN sEV dérivés du sérum de patients atteints de la maladie d’Alzheimer⁵. Une fois couplés aux dossiers de neuroimagerie et aux facteurs de risque connus de l’âge, du sexe et de la présentation de l’allèle APOE ε4, les résultats ont permis de prédire la MA avec une sensibilité de 87 % et une spécificité de 77 %. De plus, la recherche a identifié deux miARN du LCR régulés à la hausse (miR-151a-3p, let-7f-5p) et 3 miARN régulés à la baisse (miR-27a-3p, miR-125a-5p et miR-423-5p) qui peuvent potentiellement diagnostiquer la⁶ à un stade précoce. Dans le cas des maladies pathologiques, l’état pathologique peut précéder certains symptômes caractéristiques des maladies, tandis que dans le cas de la neurodégénérescence, l’accumulation de caractéristiques pathologiques se produit beaucoup plus tôt que le déclin cognitif.

Les microARN sont potentiellement un biomarqueur plus efficace que les protéines, en raison de leurs fonctions diverses et de leur régulation épigénétique d’ordre supérieur. À l’aide de tissus cérébraux, les chercheurs peuvent potentiellement identifier des signatures spécifiques de miARN sEV (BDsEV) dérivées du cerveau pour des maladies et leurs sous-types. Par exemple, les sEV avec des marqueurs neuronaux et gliaux peuvent présenter différentes cargaisons de miARN, et l’analyse peut aboutir à des méthodes plus précises de détection de la maladie. De plus, il est suggéré que les BDsEVs jouent un rôle important dans la propagation transsynaptique des protéines neuropathogènes⁷. Des rapports antérieurs ont suggéré l’immunoprécipitation et l’ultracentrifugation par gradient de densité (gradient de saccharose) pour obtenir des sEV à partir de tissus cérébraux fraîchement congelés ^8,9. Cependant, ces approches nécessitent une infrastructure spécifique avec des méthodes d’ultracentrifugation et de purification en aval pour obtenir des échantillons sEV de haute qualité¹⁰. Des rapports plus récents ont suggéré plusieurs modifications et améliorations à l’approche 11,12,13 ; Cependant, malgré cela, l’isolement et l’étude des microARN dérivés de sEV à partir de tissus humains ne sont pas encore largement appliqués. L’approche décrite dans ce protocole vise à fournir un protocole affiné, étape par étape, pour l’étude de la sEV dérivée du cerveau afin d’améliorer l’accessibilité à cette technique. Nous avons établi un protocole utilisant des quantités minimales de tissu cérébral, à partir duquel nous avons isolé des sEV purs à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique et montré des données de séquençage de nouvelle génération de haute qualité à partir de la cargaison de microARN de ces sEV.

Protocole

Le travail a été approuvé éthiquement par la Manchester Brain Bank (référence REC 09/H0906/52) et par le comité d’éthique de l’Université de Salford (ID de la demande : 3408).

1. Dégradation de la matrice intracellulaire à l’aide de la collagénase sur des coupes de tissus cérébraux congelés

1. Trancher finement 250 mg de tissu cérébral congelé (fragments d’environ 0,4 mm d’épaisseur) à l’aide d’un scalpel stérilisé sur une plaque froide et ajouter 2 ml de solution de collagénase de type III/Hibernate-E à 75 U/mL.
2. Incuber chaque échantillon dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 min. Au bout de 5 minutes, retournez chaque échantillon deux fois pour mélanger ; Au bout de 10 minutes, pipeter chaque échantillon trois fois doucement à l’aide d’une bande de plastique jetable de 10 ml.
3. Placez chaque échantillon sur de la glace et ajoutez 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase et 1x inhibiteur de phosphatase. Cela arrête la réaction enzymatique et constitue le point final de la digestion à l’aide de la collagénase de type III.
4. Centrifuger chaque échantillon de tissu cérébral à 300x g pendant 10 min à 4 °C. Prélever chaque surnageant et centrifuger une autre fois à 2000 x g pendant 15 min à 4 °C.
5. Recueillir à nouveau chaque surnageant et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm. Centrifuger chaque filtrat à 10 000 x g pendant 48 min à 4 °C.
6. Prélever le surnageant et ajouter un tampon de précipitation dans un rapport de 2:1 à chaque échantillon. Incuber toute la nuit à 4 °C.
7. Centrifuger chaque échantillon à 10 000 x g pendant 96 min à 4 °C et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de PBS exempt de vésicules extracellulaires (VE).

2. Préparation des colonnes de chromatographie d’exclusion stérique

1. Avant utilisation, équilibrez la colonne SEC pré-préparée à température ambiante (RT) pendant 15 min.
   REMARQUE : Le capuchon inférieur doit être retiré avant le capuchon à vis.
2. Après l’équilibrage, retirez le tampon de préservation du haut de la colonne et lavez-la deux fois avec 250 μL de PBS sans VE. Chaque lavage PBS est laissé pour entrer dans la colonne par gravité.

3. Isolement de petites vésicules extracellulaires à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique

1. Ajoutez la pastille remise en suspension sur le dessus de la colonne SEC et centrifugez la colonne à 50 x g pendant 30 s. Jetez le flux continu.
2. Ajoutez 180 μL de PBS sans VE au sommet de la colonne SEC et centrifugez la colonne à 50 x g pendant 1 min, en laissant les sEV dérivés du cerveau s’éluer de la colonne.
   REMARQUE : La partie du protocole détaillée ci-dessus est résumée à la figure 1.

4. Confirmation de petits marqueurs de vésicules extracellulaires par western blot

1. Pour lyser les sEV avant l’analyse par transfert Western (afin de s’assurer que toutes les cargaisons membranaires et cytosoliques sont analysées), diluez l’échantillon isolé de sEV 1:1 dans un tampon de lyse et d’extraction (1x inhibiteur de protéase et 1x inhibiteur de phosphatase).
2. Agiter l’échantillon à 4 °C pendant 30 min.
3. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 15 min.
4. Prélever le surnageant protéique et mesurer les concentrations de protéines à l’aide d’un kit de dosage des protéines.
5. Mélangez les échantillons avec 4 tampons Laemmli et chargez 20 μg de protéines dans chaque puits contre une échelle protéique pré-colorée.
6. Une fois résolues, transférez les protéines sur une membrane de nitrocellulose de 0,45 μm. Après le transfert, bloquer la membrane pendant 2 h dans 5 % de BSA.
7. Incuber les membranes avec des anticorps primaires (tableau 1) pendant la nuit.
8. Laver la membrane trois fois avec un tampon de lavage (1 % Tween20 en PBS) et colorer à l’aide d’un anticorps secondaire anti-souris. Ensuite, laver trois fois avec un tampon de lavage (1 % Tween20 en PBS).
9. Suivez les étapes ci-dessus dans le manuscrit avant d’imager les taches.
10. Image utilisant le substrat de peroxydase de raifort (HRP).

5. Confirmation de petites vésicules extracellulaires par analyse de suivi des nanoparticules (NTA)

1. Effectuez une NTA pour analyser la concentration et la taille de toutes les particules de l’échantillon. Pour ce faire, il faut diluer chaque échantillon dans du PBS à un facteur de dilution de 1:1000.
2. Injectez l’échantillon dans l’instrument NTA et lisez l’échantillon à une longueur d’onde de 550 nm. À ce stade, utilisez la quantité de particules pour mesurer la quantité de protéines par particule (généralement exprimée en femtogramme) comme recommandé dans les directives MISEV.
3. Ensuite, pour le NTA fluorescent, diluer le masque cellulaire orange (CMO) (colore toutes les particules biologiques d’un échantillon) dans le PBS par un facteur de dilution de 1:1000. À partir de là, diluez le colorant CMO à l’aide d’un échantillon sEV avec un facteur de dilution de 1:10 - Incuber cette étape de dilution dans l’obscurité pendant 30 min à 4 °C.
4. Diluer la deuxième dilution CMO à l’aide de PBS par un facteur de dilution de 1:1000.
   REMARQUE : La dilution finale du colorant CMO doit être de 1:10 000 000.
5. Lire le CMO de chaque échantillon sEV à une longueur d’onde de 550 nm à l’aide de l’instrument NTA.
6. Pour les anticorps fluorescents à la tétraspanine (voir le tableau des matériaux), diluez d’abord chaque anticorps respectif dans le PBS par un facteur de dilution de 1:10. À partir de là, diluez chacun des colorants à l’aide d’un échantillon sEV par un facteur de dilution de 1:10 - Incuber l’étape de dilution dans l’obscurité pendant 2 h à 4 °C.
7. Diluer la deuxième dilution de l’anticorps à l’aide de PBS par un facteur de dilution de 1:1000.
   REMARQUE : La dilution finale de chaque anticorps anti-tétraspanine doit être de 1:100 000.
8. Lire les lectures d’anticorps fluorescents de l’échantillon sEV à une longueur d’onde de 550 nm à l’aide de l’instrument NTA.

6. Confirmation de petites vésicules extracellulaires par microscopie électronique à transmission (MET)

REMARQUE : Ce protocole a été réalisé par l’installation de microscopie biomédicale de l’Université de Liverpool.

1. Tout d’abord, fixez les échantillons de sEV à l’aide de glutaraldéhyde et colorez-les à l’aide d’acétate d’uranyle.
2. À l’aide d’une série graduée d’alcools, déshydratez l’échantillon prêt pour le MET.
3. Imagez des échantillons à l’aide d’un microscope électronique à transmission approprié.

7. Traitement à la protéinase K et à la RNase A

1. À 50 μL de VE isolés dérivés du cerveau, ajoutez 1 μL de protéinase K à 20 μg/μL et incubez à 37 °C pendant 30 min.
2. Arrêtez chaque réaction en ajoutant 1x cocktail d’inhibiteurs de protéinase et incubez sur glace pendant 10 min.
3. Après l’incubation, ajouter 1 μL de RNase A à 10 μg/μL à chaque échantillon et incuber à 37 °C pendant 30 min.
   REMARQUE : Passez immédiatement à la section 8.

8. Isolement de l’ARN total à partir de petites vésicules extracellulaires

1. Pour isoler l’ARN total, ajoutez 700 μL de réactif de lyse de récupération de l’ARN de haute qualité à 50 μL d’échantillon d’EV dérivé du cerveau (BDsEV). Agiter chaque échantillon pendant 1 h.
2. Ajouter 140 μL de chloroforme, agiter vigoureusement chaque échantillon pendant 20 s et laisser incuber à RT pendant 3 min.
3. Centrifuger l’échantillon à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C et prélever l’interphase de l’échantillon. Ajouter 1,5 fois le volume d’éthanol à 100 %.
4. Ajouter 700 μL de mélange interphase/éthanol, colonnes d’isolement d’ARN et centrifuger à ≥8000 x g pendant 15 s à RT.
   REMARQUE : Répétez cette étape en utilisant tous les échantillons d’interphase/éthanol.
5. À la colonne, ajoutez 700 μL de tampon de lavage et centrifugez à ≥8000 x g pendant 15 s. Jetez le flux continu.
6. Ajouter 500 μL de tampon RPE et centrifuger à nouveau à ≥8000 x g pendant 15 s. Jetez le flux continu.
7. Ajouter 500 μL d’éthanol à 80 % et centrifuger à ≥8000 x g pendant 2 min. Jetez le flux continu.
8. À ce stade, séchez la membrane de la colonne en centrifugeant les colonnes à pleine vitesse (>8000 x g) pendant 5 min avec le couvercle ouvert.
9. Transférez la colonne dans un nouveau tube de collecte, ajoutez 14 μL d’eau exempte de RNase directement sur la membrane de la colonne et centrifugez à ≥8000 x g pendant 1 min pour éluer l’ARN total des BDsEV.
10. Quantifiez le microARN total à l’aide d’échantillons à l’aide d’un kit de dosage de quantification de miARN, où les échantillons ont été mesurés sur un fluorimètre de quantification, en sélectionnant le type de test de miARN.

9. Séquençage des petits ARN

1. Après la quantification des miARN dans l’échantillon, synthétisez une banque d’ADNc à l’aide du kit de préparation de bibliothèque Small RNA-Seq.
   REMARQUE : À l’aide de ce protocole, la génération de la bibliothèque comprend quatre étapes : la ligature de l’adaptateur 3', la purification, la ligature de l’adaptateur 5' et la transcription inverse - où, à la fin, une banque d’ARN/ADNc est formée. Après la génération de la bibliothèque, l’amplification par PCR finale se produit avec l’ajout d’amorces d’index (utilisées à des fins de multiplexage), après quoi les échantillons sont purifiés.
2. Pour tester la qualité de l’ARN, utilisez un test d’application de contrôle de la qualité détaillant la taille de chaque préparation et l’intensité maximale.
3. Pour tester la concentration d’ADN, mesurez la quantification de l’ADN sur un fluorimètre de quantification, en sélectionnant le type de test d’ADNdb.
4. Préparez les échantillons pour le Small RNA Seq à l’aide du kit de réactifs, après quoi les échantillons sont chargés dans la cellule d’écoulement.

Résultats

Pour confirmer la présence de BDsEVs, trois techniques ont été utilisées : le western blot, le NTA et le TEM (figure 3). Les résultats du transfert Western (figure 3A et fichier supplémentaire 1) montrent la présence des cinq marqueurs positifs (CD9, CD63, CD81, Flot-1 et TSG101) et l’absence de calnexine dans les sEV (utilisée comme témoin négatif), confirmant l’absence de contamination par le con...

Discussion

Ce protocole modifié et amélioré pour isoler les petites vésicules extracellulaires dérivées du cerveau et leur cargaison de microARN démontre la faisabilité d’utiliser un minimum de tissus sans compromettre la qualité et la quantité des produits en aval. Dans le domaine de la découverte de biomarqueurs, l’identification d’identificateurs moléculaires spécifiques aux types de cellules et de tissus peut conduire à des moyens plus accessibles de tests de diagnostic non...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Merck	A9418-100G
Cell Mask Orange Plasma Membrane Stain	ThermoFisher Scientific	C10045
Collagenase Type-III	StemCell Technologies	07422
ExoSpin Columns and Buffer	Cell Guidance Systems Ltd.	EX01-50	This kit contains SEC columns used in this experiment, precipitation buffer and EV free PBS.
Halt Protease Inhibitor Cocktail (100x)	ThermoFisher Scientific	78429
Hibernate-E Medium	ThermoFisher Scientific	A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)	BioRad	1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep Kit	Lexogen	052.24	This kit contains Small RNA preparation reagent box with i7 Index primer plate.
miRNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	217084	This kit contains high-quality RNA recovery lysis reagent (Qiazol), RNA isolation columns, isolation buffers (RWT, RPE) and RNase free water.
MiSeq Reagent Kit v3	Illumina	MS-102-3001	This is the Illumina Preparation Kit
Nitrocellulose Membrane, 0.45 μm	ThermoFisher Scientific	88018
PE/Dazzle 594 anti-human CD63 Antibody	BioLegend	143914	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD81 Antibody	BioLegend	349520	Used for fNTA Analysis
PE/Dazzle 594 anti-human CD9 Antibody	BioLegend	312118	Used for fNTA Analysis
PhosSTOP	Merck	4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049
Qubit microRNA Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32880
Qubit 1X dsDNA HS assay kit	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific	89901
RNase A	ThermoFisher Scientific	EN0531
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate	ThermoFisher Scientific	34094