Évaluation de la libération de LC3-II via les vésicules extracellulaires en relation avec l’accumulation de vésicules intracellulaires LC3-positives

Résumé

Ici, nous présentons la méthodologie permettant d’évaluer de manière concise les niveaux de marqueurs d’autophagosomes LC3-II dans les vésicules extracellulaires (VE) par immunoblottage. L’analyse des niveaux de LC3-II dans les VE, la formation d’autolysosomes et la formation d’omégasomes suggère le nouveau rôle de STX6 dans la libération de VE LC3-II positifs lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

Résumé

La (macro)autophagie représente une voie fondamentale de dégradation cellulaire. Dans ce processus, des vésicules à double membrane appelées autophagosomes engloutissent le contenu cytoplasmique, fusionnant ensuite avec les lysosomes pour la dégradation. Au-delà du rôle canonique, les gènes liés à l’autophagie modulent également une voie sécrétoire impliquant la libération de molécules inflammatoires, de facteurs de réparation tissulaire et de vésicules extracellulaires (VE). Notamment, le processus de dissémination de protéines pathologiques entre les cellules, en particulier dans les maladies neurodégénératives affectant le cerveau et la moelle épinière, souligne l’importance de comprendre ce phénomène. Des recherches récentes suggèrent que la protéine de liaison à l’ADN 43 kDa (TDP-43), un acteur clé de la sclérose latérale amyotrophique et de la dégénérescence lobaire frontotemporale, est libérée de manière dépendante de l’autophagie via les VE enrichies en protéines 1A/1B associées aux microtubules, marqueur de l’autophagosome, chaîne légère 3B-II (LC3-II), en particulier lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

Pour élucider le mécanisme sous-jacent à la formation et à la libération des VEs LC3-II-positives, il est impératif d’établir une méthode accessible et reproductible pour évaluer les vésicules LC3-II positives intracellulaires et extracellulaires. Cette étude présente un protocole détaillé pour évaluer les niveaux de LC3-II par immunoblot dans les fractions cellulaires et EV obtenues par centrifugation différentielle. La bafilomycine A1 (Baf), un inhibiteur de la fusion autophagosome-lysosome, sert de contrôle positif pour augmenter les niveaux de vésicules intracellulaires et extracellulaires LC3-II positives. Le gène de susceptibilité tumorale 101 (TSG101) est utilisé comme marqueur pour les corps multivésiculaires. En appliquant ce protocole, il est démontré que l’inhibition de la syntaxine-6 (STX6) par siRNA, un facteur de risque génétique de la maladie de Creutzfeldt-Jakob sporadique, augmente les niveaux de LC3-II dans la fraction EV des cellules traitées avec Baf sans montrer d’effet significatif sur les niveaux de TSG101. Ces résultats suggèrent que STX6 peut réguler négativement la libération extracellulaire de LC3-II via les VE, en particulier dans des conditions où la fusion autophagosome-lysosome est altérée. Combiné à des méthodes établies d’évaluation de l’autophagie, ce protocole fournit des informations précieuses sur le rôle de molécules spécifiques dans la formation et la libération de VE CL3-II positives.

Introduction

La protéine de liaison à l’ADN 43 (TDP-43) est une ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène largement exprimée impliquée dans la régulation de l’épissage des exons, la transcription des gènes et la stabilité de l’ARNm, toutes essentielles à la survie cellulaire ^1,2. Dans les maladies neurodégénératives comme la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la dégénérescence lobaire frontotemporale (FTLD), une protéine nucléaire TDP-43 s’accumule anormalement dans le cytoplasme. Ce décalage entraîne une perte de fonction de TDP-43 dans le noyau et un gain de fonction toxique dans le cytoplasme. L’accumulation pathologique de TDP-43 commence dans des régions spécifiques du cerveau et de la moelle épinière, se propageant à travers ces zones à la manière d’un prion, un processus étroitement associé à la progression de la maladie³. Cependant, le mécanisme exact par lequel la pathologie TDP-43 se propage dans le cerveau et la moelle épinière reste inconnu.

La TDP-43 est sécrétée par les vésicules extracellulaires (VE), et des niveaux élevés de TDP-43 sont détectés dans le plasma et le liquide céphalo-rachidien (LCR) des patients atteints de SLA et de FTLD-TDP ^4,5,6. Le LCR de patients diagnostiqués avec la SLA et la FTLD induit une mauvaise localisation intracellulaire et l’agrégation de TDP-43 endogène dans les cellules de gliome humain⁷. Ainsi, la TDP-43 libérée extracellulaire via les VE peut médier la propagation de cellule à cellule de la pathologie TDP-43.

L’autophagie est un mécanisme de dégradation cellulaire bien préservé qui implique l’enfermement de substances indésirables dans des vésicules à double membrane, appelées autophagosomes, qui sont marquées par LC3. Ces autophagosomes fusionnent avec les lysosomes positifs à la protéine membranaire associée aux lysosomes 1 (LAMP1) pour former des autolysosomes (LC3⁺/LAMP1⁺), entraînant la dégradation de leur contenu⁸. Les analyses histologiques indiquent que les autophagosomes engloutissant les inclusions s’accumulent dans les neurones des patients sporadiques atteints de SLA⁹. Certains gènes causaux de la SLA familiale et de la FTLD-TDP sont liés à la régulation de l’autophagie 10,11,12. Ces résultats suggèrent que l’autophagie est supprimée chez les patients atteints de SLA et de FTLD-TDP.

L’étude précédente a indiqué que TDP-43 est sécrété par des VE positifs pour le marqueur autophagosome LC3-II lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée¹³. La dérégulation de la voie autophagie-lysosome pourrait provoquer non seulement l’accumulation intracellulaire de TDP-43, mais également la libération extracellulaire de TDP-43 via les VE¹⁴. Cependant, on ne sait toujours pas comment les VE positives à LC3-II sont libérées et quelle est leur importance dans la propagation de la pathologie TDP-43.

Les VE sont classées en grandes VE (100 à 1000 nm de diamètre), qui sont produites à partir du bourgeonnement de la surface cellulaire, et en petites VE (50 à 150 nm de diamètre), qui sont produites à partir du bourgeonnement des membranes endosomiques vers l’intérieur de l’endosome (appelées exosomes) et de l’appareil de Golgi. Pour collecter séparément les grands et les petits VE, nous effectuons une centrifugation séquentielle et collectons les granulés par centrifugation à 20 000 × g et 110 000 × g, respectivement. La fraction P1 EV (20 000 × g de granulés) est préparée pour collecter de gros VE, et la fraction P2 EV (110 000 × g de granulés) est préparée pour collecter de petits^VE15. La méthodologie d’évaluation des niveaux de CL3-II dans les VE de grande et de petite taille dérivée de la centrifugation séquentielle par immunobuvardage est stable et reproductible¹⁶. En plus d’analyser les niveaux de LC3-II dans les VE, l’analyse de la formation des autolysosomes et des omégasomes permet de mieux comprendre comment la dérégulation de l’autophagie conduit à la libération de VE positifs LC3-II. Ici, la présente étude montre le rôle suppressif de la syntaxine 6 (STX6), une protéine SNARE, qui favorise le mouvement des vésicules de transport vers les membranes cibles¹⁷, dans la libération d’VE positives LC3-II lorsque la fusion autophagosome-lysosome est inhibée.

Protocole

1. Préparation de la cellule, de la fraction P1 et de la fraction P2 EV à partir du milieu cultivé de cellules HeLa

1. Préparation de la fraction P1 et P2 EV à partir du milieu cultivé de cellules HeLa
   1. Jour 1
      1. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁶ cellules sur une plaque de 6 cm contenant un milieu de culture composé de DMEM High Glucose, de 10 % de FBS et de 1 % de pénicilline/streptomycine. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
   2. Jour 2 (facultatif)
      1. Préparez une solution de siRNA de 20 μM.
      2. Mélangez 100 μL de milieu sérique réduit et 3 μL d’ARNi dans un tube à faible rétention pour préparer la solution A.
      3. Mélanger 100 μL de milieu sérique réduit et 5 μL de réactif de transfection dans un tube à faible rétention pour préparer la solution B.
      4. Mélangez la solution A et la solution B, puis incubez le mélange à température ambiante (RT) pendant 5 min.
      5. Ajouter le mélange des solutions A et B au milieu utilisé pour la culture des cellules HeLa. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
   3. Jour 3
      1. Lavez les cellules avec du PBS et exposez-les à 500 μL de trypsine à 0,25 % et à une solution d’EDTA 1 mM à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 5 min.
      2. Ajoutez 2,5 ml du milieu de culture dans les cellules et utilisez une pipette de transfert Pasteur avec une pointe de pipette de 200 μL pour préparer une suspension unicellulaire.
      3. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁶ cellules sur une plaque de 10 cm. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
         REMARQUE : Il est nécessaire de préparer au moins 1 × 10^{cellules 6} pour collecter les VE du milieu de culture requis pour l’analyse par immunobuvardage.
   4. Jour 4
      1. Préparez un milieu de culture (voir l’étape 1.1.1.1) contenant soit un véhicule (DMSO), soit 100 nM de bafilomycine A1 (Baf).
      2. Exposez les cellules au milieu contenant soit du véhicule, soit du Baf de 100 nM et incubez-les à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
   5. Jour 5
      1. Prélevez tout le milieu de culture de la plaque de 10 cm, transférez-le dans un tube de 15 ml et centrifugez-le à 3 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires.
         REMARQUE : Les cellules restantes de la plaque de 10 cm seront utilisées à la section 1.2.1.
      2. Pour l’isolement de la fraction P1 EV, transvaser le surnageant après centrifugation à 3 000 × g dans un tube de centrifugation, puis le centrifuger à 20 000 × g à 4 °C pendant 1 h.
      3. Pour l’isolement de la fraction P2 EV, transvaser le surnageant après centrifugation à 20 000 × g dans un tube d’ultracentrifugation, puis le centrifuger à 110 000 × g à 4 °C pendant 1 h.
      4. Après avoir essuyé l’excès d’humidité à l’intérieur du tube avec une lingette de laboratoire, mettez à nouveau en suspension les granulés restants dans le tube de centrifugation dans 50 μL de tampon d’échantillon 2x [2,5 % SDS, 125 mM tampon Tris-HCl (pH 6,8), 30 % de glycérol, 10 % de 2-mercaptoéthanol, 0,4 % de bleu de bromophénol] pour préparer la fraction P1 EV.
      5. Retirez le surnageant par décantation, essuyez l’excès d’humidité à l’intérieur du tube avec une lingette de laboratoire, puis mettez à nouveau en suspension les pastilles restantes dans le tube d’ultracentrifugation dans 50 μL de tampon d’échantillon 2x pour préparer la fraction P2 EV.
      6. Incuber les fractions P1 et P2 EV à 100 °C sur un bloc chauffant pendant 10 min.
         REMARQUE : Ne secouez pas les tubes après la centrifugation à 20 000 × g et 110 000 × g pour éviter de jeter accidentellement les granulés restants. Après avoir incliné le tube pour transférer le surnageant, maintenez la position du tube pour éviter que la pastille ne soit à nouveau immergée dans le surnageant restant.
2. Préparation de la fraction cellulaire à partir de cellules HeLa cultivées
   1. Jour 5
      1. Après le transfert du milieu de culture de la plaque de 10 cm dans un tube de 15 mL, laver les cellules dans la boîte de 10 cm avec du PBS et les exposer à 2 mL de trypsine à 0,25 % et à 1 mM de solution d’EDTA à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 5 min.
      2. Ajouter 8 mL de milieu de culture dans les cellules, puis utiliser une pipette de transfert Pasteur avec une pointe de pipette de 200 μL pour pipeter les cellules et préparer une suspension unicellulaire.
      3. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifugez-la à 1 000 × g pendant 10 min à 4 °C.
      4. Retirer le surnageant à l’aide d’un aspirateur, ajouter du PBS à la pastille de cellule, puis centrifuger à 1 000 × g pendant 5 min à 4 °C.
      5. Retirer le PBS à l’aide d’un aspirateur et sonicer la pastille cellulaire dans 1 mL de tampon A68 [10 mM de tampon Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M de NaCl, 1 mM d’éthylène glycol bis(β-aminoéthyl éther)-N,N,N,N-acide tétraacétique (EGTA)] contenant 1 % de sarkosyl.
      6. Mesurez la concentration protéique du lysat cellulaire à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA.
      7. Mélangez 300 μL de lysat cellulaire avec 100 μL de tampon d’échantillon 4x et incubez le mélange à 100 °C sur un bloc chauffant pendant 10 min pour préparer la fraction cellulaire.

2. Analyse par immunobuvardage

1. Séparer les quantités équivalentes de protéines dans les échantillons par SDS-PAGE¹⁸.
2. Transférez les protéines séparées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF).
3. Après le transfert, bloquez les membranes avec l’agent bloquant pendant 20 min.
4. Incuber la membrane bloquée pendant la nuit avec l’anticorps primaire indiqué dans le tampon Tris contenant 10 % (v/v) de sérum de veau à RT.
5. Laver la membrane avec un tampon Tris pendant 5 s, puis l’incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la biotine à RT pendant 2 h.
6. Laver la membrane avec le tampon Tris pendant 5 s, puis l’incuber avec le tampon Tris contenant 0,4 % (v/v) des solutions A et B du kit à RT pendant 1 h.
7. Lavez la membrane avec du PBS, puis incubez-la avec du PBS contenant 0,04 % (p/v) de diaminobenzidine, 0,8 % (p/v) de NiCl₂·6H₂O et 0,3 % (v/v) de H₂O₂ pour la détection colorimétrique des bandes.
   REMARQUE : Pour la détection de signaux, une méthode de chimiluminescence est également acceptable.
8. Numériser l’image de la membrane à l’aide d’un scanner et la soumettre à une analyse densitométrique à l’aide des Fidji.
   1. Ouvrez l’image numérisée à l’aide de Fidji et convertissez l’image couleur RVB en image 8 bits en cliquant sur Image | Type | 8 bits.
   2. Cliquez sur l’outil rectangle et ajustez la taille du rectangle en le faisant glisser pour entourer les bandes. Identifiez la bande à analyser en cliquant sur Analyser | Gels | Sélectionnez Première voie.
   3. Positionnez le rectangle sur la deuxième bande et les suivantes, puis identifiez les bandes à analyser en cliquant sur Analyser | Gels | Sélectionnez Voie suivante.
   4. Après avoir reconnu la bande finale, mesurez la densitométrie sur le rectangle en cliquant sur Analyser | Gels | Voies de l’intrigue.
   5. Entourez la zone du signal de la bande d’une ligne droite, cliquez sur l’outil baguette, puis cliquez dans la zone pour calculer l’intensité du signal de la bande.

3. Analyse du nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes

1. Jour 1
   1. Comptez le nombre de cellules HeLa à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁵ cellules HeLa exprimant LAMP1-GFP et mCherry-LC3 sur une boîte de 3,5 cm. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
2. Jour 2 (facultatif)
   1. Effectuez les étapes décrites à la section 1.1.2 dans des plats de 3,5 cm.
3. Jour 3
   1. Jeter le milieu de culture des plats de 3,5 cm.
   2. Laver les cellules avec du PBS, les exposer à 400 μL de solution de trypsine à 0,25 % et d’EDTA à 1 mM, et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 5 min.
   3. Ajoutez 1,6 mL du milieu de croissance dans les cellules et pipetez-les avec une pipette de transfert Pasteur pour préparer une suspension unicellulaire.
   4. Comptez le nombre de cellules à l’aide du compteur de cellules et amorcez 1 × 10⁴ cellules sur une lamelle à 8 chambres. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
      REMARQUE : Deux puits de lamelle à chambre sont préparés pour les cellules de contrôle et de neutralisation STX6, respectivement, après un traitement au DMSO ou au Baf, tel que décrit à la section 3.4.2.
4. Jour 4
   1. Préparez le milieu de culture sans rouge de phénol (DMEM sans rouge de phénol, 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine), contenant soit un véhicule (DMSO), soit 100 nM de Baf dissous dans du DMSO.
   2. Remplacer le milieu de culture par un milieu sans rouge de phénol, contenant soit du véhicule, soit du Baf de 100 nM, et incuber pendant 4 h.
      REMARQUE : Pour évaluer l’effet de Baf sur le nombre d’autophagosomes et d’autolysosomes, préparer des cellules traitées comme témoins.
   3. Teindre les noyaux avec 0,33 μg/mL de Hoechst 33342 pendant 30 min avant l’observation.
   4. Effectuez l’imagerie de cellules vivantes à l’aide d’un objectif 60x sur un microscope laser confocal et capturez dix images différentes.
      1. Ouvrez l’image fusionnée RVB aux Fidji et divisez-la en composants d’image respectifs rouge, vert et bleu en cliquant sur Image | Couleur | Diviser les chaînes.
      2. Définissez un seuil constant pour les signaux rouge et vert dans chaque image en cliquant sur Image | Ajuster | Seuil pour chaque expérience.
      3. Comptez le nombre de zones positives pour les signaux rouges ou verts en cliquant sur Analyser | Analysez les particules. Cochez la case Résumer , puis cliquez sur OK. Enregistrez les valeurs du dénombrement pour identifier les vésicules associées aux autophagosomes et aux lysosomes.
      4. Pour superposer l’image verte sur l’image rouge, réglez le mode de transfert sur ET en cliquant sur Modifier | Contrôle de collage. Copiez l’image verte, puis collez-la sur l’image rouge pour les fusionner, en mettant en évidence les zones positives pour les signaux rouges et verts.
      5. Pour identifier le nombre d’autolysosomes, comptez le nombre de zones positives pour les signaux rouges et verts en cliquant sur Analyser | Analysez les particules. Cochez la case Résumer , cliquez sur OK et enregistrez les valeurs dans la section Nombre pour identifier les vésicules associées aux autophagosomes et aux lysosomes.
   5. Divisez le nombre total d’autolysosomes et d’autophagosomes par le nombre total de cellules pour calculer le nombre d’autolysosomes et d’autophagosomes par cellule.
      REMARQUE : Comptez au moins 35 cellules dans chacune des trois expériences indépendantes.

4. Analyse de la formation des omégasomes

1. Jour 1
   1. Comptez le nombre de cellules HeLa à l’aide d’un compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁵ cellules sur une parabole de 3,5 cm. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
2. Jour 2 (facultatif)
   1. Effectuez les étapes décrites à la section 1.1.2.
3. Jour 3
   1. Préparez une suspension à cellule unique comme décrit aux étapes 3.3.1 à 3.3.2.
   2. Comptez les cellules à l’aide du compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁵ cellules sur une parabole de 3,5 cm. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
4. Jour 4
   1. Mélangez 1 μg de pEGFP-C1-hAtg13, 3 μL de réactif de transfection de l’ADN et 100 μL de milieu sérique réduit dans un tube à faible rétention. Incuber le mélange pendant 20 min, puis l’ajouter au milieu de culture.
   2. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
5. Jour 5
   1. Trypsinisez les cellules comme décrit aux étapes 3.3.1-3.3.2.
   2. Ajouter 2,5 ml du milieu de croissance aux cellules. Pipeter le mélange à l’aide d’une pipette de transfert Pasteur pour préparer une suspension unicellulaire.
   3. Comptez les cellules à l’aide du compteur de cellules et ensemencez 1 × 10⁴ cellules sur une lamelle à 8 chambres. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ et une humidité contrôlée pendant 24 h.
6. Jour 6
   1. Suivez les étapes 3.4.1 à 3.4.4 pour effectuer l’imagerie des cellules vivantes à partir de l’étape 4.5.3 à l’aide d’un microscope laser confocal. Capturez dix images différentes.
      1. Suivez les étapes 3.4.4.1 à 3.4.4.3 pour diviser les images fusionnées RVB en composantes d’image rouge, verte et bleue respectives, définir un seuil constant pour les signaux verts dans chaque image et déterminer l’intensité du signal GFP. Enregistrez les valeurs de la section Surface totale pour déterminer l’intensité du signal GFP-ATG13.
      2. Divisez l’intensité totale du signal par le nombre de cellules examinées pour calculer l’intensité du signal par cellule.
         REMARQUE : Comptez au moins 34 cellules dans chacune des trois expériences indépendantes.

Résultats

Comme l’ont montré des études antérieures, le traitement par Baf a augmenté les niveaux de TSG101 (P1 : P < 0,01, P2 : P = 0,012, tels que déterminés par l’ANOVA à deux facteurs dans EZR¹⁹) et LC3-II (P1 : P < 0,01, P2 : P < 0,01, tels que déterminés par l’ANOVA à deux facteurs dans EZR¹⁹) dans la fraction riche en VE. Notamment, le traitement Baf a également augmenté les niveaux de STX6 (P1 : P < 0,01, P2 : P < 0,01, tels...

Discussion

L’étude d’immunoblot a révélé des niveaux de LC3-II et de TSG101 dans la fraction cellulaire, la fraction P1 EV riche en microvésicules et la fraction P2 EV riche en exosomes. L’imagerie de cellules vivantes a été utilisée pour examiner les autophagosomes, les autolysosomes et les omégasomes, ce qui a permis de déterminer si l’inactivation de STX6 influence l’autophagie. Ces résultats combinés suggèrent que l’inactivation de STX6 affecte la lib?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 % Trypsin EDTA	Fujifilm Wako	201-16945
10 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150464
15 mL Tube	Thermo Fisher Scientific	339650
200 μL Pipette Tip	Nippon Genetics	FG-301	pipetting
2-Mercaptoethanol	Nacalai Tesque	21417-52	a material for sample buffer solution
3,3'-Diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Nacalai Tesque	11009-41	a material for DAB solution
3.5 cm Dish	Thermo Fisher Scientific	150460
6 cm Dish	TrueLine	TR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)	EYELA	273860
Aspirator	SANSYO	SAP-102	inhaling solution
Avanti JXN-30	Beckman Coulter	B34193
Bafilomycin A1	Adipogen	BVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	2nd antibody for immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-2000	2nd antibody for immunoblotting
Blocking One	Nacalai Tesque	03953-95	a material for immunoblotting
Bromophenol Blue	Nacalai Tesque	05808-61	a material for sample buffer solution
Calf Serum	cytiva	SH30073.03
CanoScan LiDE 220	Canon	CSLIDE220	Scanner
Centrifuge 5702 R	eppendolf	5703000039
Counting Slides Dual Chamber	Bio-Rad	1450015J	cell counting
Digital Sonifier 450	BRANSON
Dimethyl Sulfoxide	nacalai tasque	09659-14	vehicle
DMEM High Glucose	Nacalai Tesque	08458-45	culture medium
DMEM without Phenol Red	Nacalai Tesque	08489-45	culture medium
EGTA	Dojindo	348-01311	a material for A68 solution
Excel	Microsoft	version 16.16.27	satistical analysis
EZR	Reference No. 24	version 1.68	satistical analysis
FBS	Sigma	173012	Culture medium
Fiji	NIH		Image analysis tool
Glycerol	Nacalai Tesque	09886-05	a material for sample buffer solution
Hoehst33342	Dojindo	H342
Hydrogen Peroxide	Fujifilm Wako	080-0186	a material for DAB solution
Kimwipe S-200	NIPPON PAPER CRECIA	62011	cleaning wipe
Low Retention Tube	Nippon Genetics	FG-MCT015CLB	siRNA and DNA transfection
LSM780 Confocal Laser Microscope	Carl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 Antibody	MBL	M186-3	1st antibody for immunoblotting
Nickel(II) Chloride Hexahydrate	Fujifilm Wako	149-01041	a material for DAB solution
N-Lauroylsarcosine Sodium Salt	Nacalai Tesque	20117-12
Optima XE-90 Ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985-070	siRNA and DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13	Addgene	22875
Penicillin/Streptomycin	Nacalai Tesque	26253-84	Culture medium
Pierce BCA Protein Assay Kits	Thermo Fisher Scientific	23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA Antibody	BioAcademia	70-080	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 Antibody	ProteinTech	10841-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 Antibody	ProteinTech	28283-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 Antibody	ProteinTech	20986-1-AP	1st antibody for immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride Membrane	Milliore	IPVH00010	a material for immunoblotting
R	R development core team	version 4.4.1	satistical analysis
RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778	siRNA transfection reagent
siRNA STX6	Thermo Fisher Scientific	HSS115604	siRNA for transfection
Sodium Chloride	Nacalai Tesque	31320-05	a material for Tris buffer and A68 solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Fujifilm Wako	192-13981	a material for sample buffer solution
SPARK Microplate Reader	TECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GC	Thermo Fisher Scientific	12935300	siRNA transfection
Sucrose	Fujifilm Wako	193-00025	a material for A68 solution
TC20 Automated Cell Counter with Thermal Printer	Bio-Rad	1450109J1	cell counting
Thermobath	TOKYO RIKAKIKAI	MG-3100	incubation
TransIT-293	Mirus Bio	MIR 2700	DNA transfection reagent
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR2300	DNA transfection reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Nacalai Tesque	35406-75	a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution
Trypan Blue Dye 0.40%	Bio-Rad	1450021	cell counting
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm	Beckman Coulter	361706	collecting for the P1 EV fraction
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Coulter	344059	collecting for the P2 EV fraction
Vectastain ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	immunoblotting
Wash Bottle	As One	1-4640-02	washing membrane
μ-Slide 8 Well High	ibidi	80806