Formulation de nanomatériaux à base de zinc à partir de l’extrait d’écorce d’Eucommia ulmoides et de leur potentiel de cicatrisation

Résumé

Nous présentons ici un protocole permettant de synthétiser les nanoparticules d’oxyde de zinc (ZnO) à l’aide de l’extrait aqueux riche en polyisoprène obtenu à partir de l’écorce d’arbre Eucommia ulmoides . Le potentiel de cicatrisation des plaies présenté par les nanoparticules de ZnO synthétisées sur les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC) a été évalué à l’aide d’un test de grattage, une méthode simple, rentable et efficace.

Résumé

L’extrait aqueux de l’écorce d’Eucommia ulmoides est une riche source de composés bioactifs avec de nombreux avantages pour la santé. Le protocole vise ici à explorer la préparation de nanoparticules d’oxyde de zinc (ZnO) à l’aide de l’extrait aqueux riche en polyisoprène médié par l’écorce d’Eucommia ulmoides . Pendant ce temps, le protocole proposé est associé à la préparation du matériel de cicatrisation des plaies en facilitant le processus. De plus, le potentiel de cicatrisation des nanoparticules synthétisées (Eu-ZnO-NPs) a été évalué à l’aide d’un simple test de grattage sur une monocouche de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Après 24 h de traitement avec des NP-Eu-ZnO, la prolifération cellulaire et la migration des cellules HUVEC ont été évaluées. À la fin de l’étude, une prolifération et une migration cellulaires ont été observées dans des monocouches rayées traitées avec différentes concentrations d’Eu-ZnO-NPs, tandis que de faibles taux de migration et de prolifération cellulaires ont été observés dans les cellules témoins. Parmi les concentrations choisies, 20 μg/mL de nanomatériaux Eu-ZnO ont montré une meilleure migration cellulaire et un potentiel de cicatrisation des plaies accru.

Introduction

Il a été démontré que les plantes médicinales et les composés dérivés de plantes présentent de nombreux avantages pour la santé¹. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a indiqué que 80 % de la population mondiale dépend des plantes médicinales traditionnelles pour les soins de santé primaires. La Chine est bien connue et populaire pour ses pratiques de médecine traditionnelle chinoise (MTC). Les herbes médicinales chinoises ont été signalées pour traiter diverses maladies et utilisées pour leur potentiel biologique. Les plantes médicinales servent de réservoirs de composés bioactifs et de multiples rôles thérapeutiques. Des plantes médicinales ont également été utilisées pour traiter les blessures. Il existe plusieurs types d’approches appliquées pour traiter les plaies chroniques². Une enquête récente a révélé que les plantes médicinales étaient impliquées dans le processus de cicatrisation des plaies en fournissant des conditions favorables à la cicatrisation, exemptes d’infections, et en fixant la régénération des tissus³. Pendant ce temps, les propriétés antibactériennes et antifongiques des composés bioactifs présents dans les plantes médicinales peuvent aider à guérir les plaies et à accélérer l’efficacité de la cicatrisation des plaies⁴.

Les nanomatériaux à base de métaux attirent l’attention en raison de leurs propriétés biocompatibles et biodégradables. Eucommia ulmoides, communément appelé l’hévéa chinois, est une espèce originaire de Chine. Les feuilles et l’écorce de l’arbre sont utilisées dans les pratiques médicinales. Plus important encore, l’espèce végétale a été cultivée dans les provinces du centre et de l’ouest de la Chine⁵. Peng et ^al.6ont rapporté que les feuilles, les écorces et les fleurs staminées étaient comestibles avec un potentiel thérapeutique. De plus, E. ulmoides est la meilleure source de lignanes, de phénylpropanoïdes, d’iridoïdes, de flavonoïdes, d’acides aminés et d’oligo-éléments. De plus, l’écorce a été utilisée pour diverses applications biomédicales telles que le contrôle de la pression artérielle, la réduction des graisses et la promotion de l’antiostéroporose et de l’activité hypoglycémiante⁷. Par conséquent, il a sans aucun doute été prouvé que l’extrait d’écorce d’E. ulmoides a une longue histoire dans la médecine traditionnelle chinoise. Des rapports antérieurs suggéraient que le polymère naturel polyisoprène est riche en écorces d’Eucommia ulmoides⁸. Sur la base des informations ci-dessus, le présent travail vise à fabriquer des nanomatériaux à partir d’extraits d’écorce d’Eucommia ulmoides . La combinaison de zinc et d’extrait d’écorce est un choix attrayant pour la préparation de nanomatériaux. Dans l’ensemble, l’objectif ultime de la présente étude était de fabriquer un nouveau nanomatériau hybride pour des applications de cicatrisation des plaies.

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Protocole

REMARQUE : Avant de préparer l’extrait, le matériau d’écorce obtenu a été lavé deux fois à l’eau déminéralisée et séché dans un endroit ombragé. Les écorces séchées à l’ombre ont été stockées dans un contenant hermétique.

1. Préparation de l’extrait d’écorce d’Eucommia ulmoides

1. Hachez l’écorce récoltée sur l’arbre Eucommia ulmoides en petits morceaux à l’aide de ciseaux.
2. Lavez les matériaux d’écorce hachés deux fois avec de l’eau distillée deux fois.
3. Faites sécher les morceaux d’écorce à moins de 37 °C pendant 24 h dans des conditions ombragées.
   1. Ajustez la durée du processus de séchage en fonction de la quantité d’écorce utilisée pour l’étude. Assurez-vous que les écorces sont complètement sèches avant de les couper en petits morceaux. Évitez la lumière directe du soleil.
4. Transvaser 20 g d’écorces séchées à l’ombre dans une fiole conique contenant 220 mL d’eau stérile double distillée et chauffer à 130 °C pendant 20 min.
   1. La couleur de la solution réactionnelle vire au jaune clair. Les changements de couleur de la solution se produisent après 10 min. Laissez la solution chauffer pendant encore 10 min. Ajustez le volume d’eau distillée deux fois en fonction de la quantité d’échantillon.
5. Conservez l’extrait brut contenant du polyisoprène à 4 °C pour une utilisation ultérieure. La formation d’une structure filiforme indique la présence de polyisoprène dans les extraits.

2. Biosynthèse de nanoparticules de ZnO médiées par l’écorce d’E. ulmoides

1. Ajouter 1 M de nitrate de zinc dihydraté Zn (NO₃)₂ à 50 mL d’eau désionisée dans une fiole conique de 500 mL. Agitez en continu à l’aide d’un brassage magnétique (60 tr/min). Le Zn (NO₃)₂ met 30 minutes à se dissoudre complètement.
2. Ajouter 15 mL d’extrait d’écorce d’E. ulmoides goutte à goutte à 20 mL de solution de nitrate de zinc dihydraté (Zn (NO₃)₂).
3. Placez le mélange réactionnel couvert sur un agitateur magnétique, allumez l’agitateur et faites-le tourner à (60 tr/min) pendant 3 h.
4. Ajouter 1 solution d’hydroxyde de sodium 1 N NaOH (3 mL) goutte à goutte au mélange réactionnel pour ajuster le pH à 9. Ajoutez du NaOH jusqu’à ce que le mélange de solution devienne blanc laiteux et que le pH ne dépasse pas 9. La solution prend une couleur blanc laiteux lorsque des nanoparticules de ZnO se forment.
   1. La préparation de 1 M de volume de solution de nitrate de zinc dihydraté Zn (NO₃)₂ peut varier en fonction des besoins expérimentaux. Assurez-vous d’utiliser les extraits d’écorce fraîchement préparés. Si le pH dépasse 10, cela entraînera une agrégation de nanoparticules.
5. Transvasez les Eu-ZnO-NPs synthétisés dans un tube à centrifuger de 50 mL et centrifugez-le à 100 x g pendant 5 min à 4 °C.
   REMARQUE : Les impuretés peuvent être évitées par un lavage immédiat.
6. Recueillir les Eu-ZnO-NPs lavés dans une plaque de verre et les faire sécher à 45-50 °C pendant 1 h dans un four à air chaud.
   REMARQUE : Si les Eu-ZnO-NPs sont conservés pendant plus de 30 minutes, cela peut affecter la nature physicochimique des nanoparticules

3. Confirmation de la taille à l’aide de la GDT

1. Préparez 1 mg/mL de nanoparticules dans du DDH₂O et chargez 5 μL d’échantillon Eu-ZnO-NP dans la grille de cuivre et attendez qu’il sèche complètement. Vortex l’échantillon avant de le charger sur la grille de cuivre.
2. Chargez la grille de cuivre contenant les Eu-ZnO-NPs sur le support d’échantillon TEM et acquérez des images à des grossissements de 50x et 100x.
   REMARQUE : Les grilles doivent être ramassées à l’aide d’une pince à épiler au cours de cette étape.

4. Évaluation de la cytotoxicité

1. Semez 1 × 10⁴ HUVECs dans chaque puits d’une plaque de 96 puits et placez-le dans un incubateur à 5 % de CO₂ 37 °C.
2. Ajouter 10 μL de différentes concentrations de 0, 10, 20, 30, 40 et 50 μg/mL d’Eu-ZnO-NPs dans les cellules confluentes à 90 % et incuber pendant 24 h.
3. Après l’incubation, retirer l’ancien milieu sans déranger les cellules, ajouter 10 μL de solution de CCK-8 dans chaque puits contenant 90 μL de milieu DMEM frais, et incuber dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
4. Mesurer l’absorbance des cellules traitées avec la solution de CCK8 à 450 nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
   REMARQUE : L’absorbance a été mesurée immédiatement dans les 15 minutes pour éviter les changements d’absorbance.

5. Préparation des cellules HUVEC pour le test de grattage

1. Ensemencer une quantité appropriée (1 × 10⁵) de HUVECs dans des plaques de culture à 12 puits contenant le milieu Eagle modifié de Dulbecco avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pen-streptocoque et l’incuber dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C.
   1. Avant d’effectuer le test de rayure, vérifiez la confluence à l’aide du microscope inversé.
      REMARQUE : Pour effectuer le test de rayure, 6 plaques de puits ou 12 plaques seront utilisées en fonction des exigences, et la densité cellulaire variera pour différentes plaques de culture. L’utilisation de cellules confluentes de 70 à 80 % est idéale et recommandée pour le dosage des rayures. Le volume du milieu DMEM peut varier en fonction des plaques de culture utilisées dans l’étude. Par exemple, les plaques à 6 puits nécessitent 1 à 1,5 mL de milieu de culture, et les plaques à 12 puits nécessitent 0,5 à 1,0 mL de milieu de culture.
2. Faites une égratignure délicate à l’aide d’une pointe de pipette stérile de 200 μL dans la plaie représentative d’une largeur de plaie de 200 μm.
3. Assurez-vous que la pointe utilisée pour faire des rayures sur la monocouche de cellules entre en contact avec la surface des cellules.
   REMARQUE : Chaque fois qu’une égratignure est faite, utilisez l’embout stérile.
4. Retirez le milieu complet et lavez la monocouche HUVEC à l’aide de 1 mL de 1x PBS pour retirer les cellules détachées.
   REMARQUE : Assurez-vous que les cellules monocouches détachées sont complètement retirées des puits respectifs. Confirmez qu’aucun dommage n’a été causé dans la zone créée par la plaie.
5. Pour évaluer le potentiel de cicatrisation des NP-Eu-ZnO synthétisés, ajoutez dans les puits des concentrations de 0 (contrôle), 10 et 20 μg/mL de nanoparticules d’Eu-ZnO combinées à un milieu complet contenant 10 % de FBS. Maintenir les plaques expérimentales à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ .
   REMARQUE : Ne dérangez pas la monocouche cellulaire lors de l’ajout du milieu frais et complet. Veiller à ce que les cellules monocouches ne soient pas perturbées pendant l’incubation.
6. Acquérir des microphotographies à 0 h et 24 h à l’aide d’un microscope inversé. Utilisez l’outil d’annotation pour mesurer la fermeture de la plaie à différents intervalles de temps.
   1. Calculez le pourcentage de fermeture de la plaie à l’aide de la formule suivante : Fermeture de la plaie ( %) = [(migration cellulaire (en μm) à 0 h - migration cellulaire (en μm) à 24 h)/ migration cellulaire (en μm) à 0 h] x 100.

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Résultats

La présente étude vise à synthétiser des nanoparticules à l’aide d’écorces d’arbres Eucommia ulmoides . L’écorce a été complètement séchée dans un environnement ombragé (figure 1). Les matériaux écorciers ont été utilisés pour préparer l’extrait aqueux de brut à l’eau chaude en chauffant les échantillons à 130 °C pendant 20 min. Une légère altération de la température et de la durée peut perturber les phytocom...

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Discussion

On pense que l’écorce, les graines et les feuilles d’E. ulmoides présentent de nombreux avantages pour la santé. Nos résultats ont montré que la synthèse des nanoparticules EU-ZnO a été réalisée à l’aide d’une approche simple et rentable. L’extrait aqueux a été utilisé pour synthétiser les nanoparticules. Le chauffage de l’écorce à haute température peut entraîner la dégradation de certains phytoconstituants et réduire l’efficacité de l’extr...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis