Mise au point d’un système protoplaste du chou pour l’étude de la tolérance à l’hypoxie chez les brassicacées

Résumé

Ce protocole décrit un système efficace de protoplastes du mésophylle du chou. Divers traitements déficients en oxygène ont été testés, et le système a montré une forte activation des gènes sensibles à l’hypoxie, facilitant l’étude des mécanismes génétiques et moléculaires de la tolérance aux inondations chez les légumes Brassicaceae .

Résumé

Alors que le changement climatique entraîne des précipitations plus abondantes, le chou, un légume clé des Brassicaceae , fait face à d’importantes pertes de rendement en raison du stress d’hypoxie induit par les inondations. Pour identifier les mécanismes de tolérance à l’inondation chez les choux, une plate-forme polyvalente pour les études fonctionnelles génétiques est nécessaire pour surmonter la nature récalcitrante de la transformation des choux. Dans cette étude, un système d’expression transitoire du protoplast du chou et un protocole d’induction de l’hypoxie du protoplast correspondant ont été développés. Ce protocole a permis d’obtenir un rendement élevé et une intégrité d’isolement des protoplastes à partir de feuilles de chou, avec une efficacité de transfection supérieure à 40 % en utilisant des conditions enzymatiques optimisées. Pour atténuer l’influence hypoxique potentielle avant les traitements, la solution W5 a été remplie de bulles d’oxygène gazeux pour augmenter les niveaux d’oxygène dissous. Plusieurs produits chimiques pour ajuster les niveaux d’oxygène et les traitements physiologiques de piégeage de l’oxygène ont été testés, notamment l’EC-Oxyrase, l’OxyFluor, le sulfite de sodium et un absorbeur d’oxygène. Des tests à double luciférase ont montré que les promoteurs des gènes de réponse respiratoire anaérobie BoADH1 et BoSUS1L étaient activés dans les protoplastes du chou après des traitements par hypoxie, le niveau d’induction le plus élevé étant observé après un traitement avec l’absorbeur d’oxygène. En résumé, le système d’expression transitoire du protoplast du chou combiné au traitement par hypoxie démontre une plate-forme efficace et pratique. Cette plateforme peut faciliter l’étude de la fonction des gènes et des mécanismes moléculaires associés aux réponses à l’hypoxie chez les choux.

Introduction

Le changement climatique mondial a exacerbé les inondations, qui sont devenues un problème de plus en plus critique dans le monde entier. Au cours des dernières décennies, on a assisté à une tendance à la hausse de la fréquence des inondations, ce qui a entraîné des pertes de récoltes^{substantielles1,2}. Le chou (Brassica oleracea var. capitata L.), un légume d’importance mondiale importante, est sensible aux effets néfastes des fortes pluies, ce qui nécessite le développement de cultivars de chou tolérants aux inondations pour assurer une production durable face aux événements météorologiques extrêmes. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes moléculaires associés au stress lié aux inondations chez le chou pour relever ce défi.

Pour comprendre les mécanismes de régulation des gènes chez les plantes submergées, les lignées transgéniques sont largement utilisées pour les études fonctionnelles génétiques. Cependant, cette approche est limitée par des coûts élevés, des processus de transformation et de sous-culture chronophages, ainsi que par de faibles efficacités de transformation chez de nombreuses espèces cultivées, ce qui nécessite le développement de méthodologies alternatives. Les systèmes d’expression transitoire basés sur les protoplastes ont été largement appliqués dans la recherche moléculaire végétale en tant qu’alternative polyvalente et efficace. Ces systèmes facilitent l’étude de l’activité des promoteurs, des voies de signalisation en réponse aux signaux environnementaux, des interactions protéine-protéine ou protéine-ADN et de la localisation subcellulaire³. L’établissement de systèmes d’expression transitoires de protoplastes a été signalé non seulement chez des plantes modèles ^4,5, mais aussi dans des cultures économiquement importantes telles que la canne à sucre⁶, l’œillet⁷, les orchidées Phalaenopsis ⁸ et l’aubergine⁹. De plus, ces systèmes ont été mis en œuvre avec succès dans des plantes ligneuses, notamment Camellia oleifera¹⁰et Populus trichocarpa¹¹. Cependant, les protocoles d’application des systèmes de protoplastes pour étudier les légumes-feuilles sous stress d’hypoxie induit par la submersion sont limités. Par conséquent, un protocole intégré a été développé dans ce travail pour ceux qui s’intéressent à l’étude des réponses à l’hypoxie dans les légumes-feuilles à l’aide d’un système d’expression transitoire du protoplast du chou.

Pour effectuer la réponse d’hypoxie induite par la submersion au niveau cellulaire, plusieurs méthodologies de piégeage de l’oxygène ont été employées dans des études précédentes pour simuler des environnements hypoxiques. Il s’agit notamment de l’utilisation d’EC-Oxyrase, d’OxyFluor, de sulfite de sodium et de sacs consommateurs d’oxygène. L’EC-Oxyrase est généralement utilisée pour le traitement anaérobie dans les lignées cellulaires humaines¹² et les protoplastes d’Arabidopsis ¹³. L’OxyFluor s’est avéré efficace pour atténuer le photoblanchiment causé par les espèces réactives de l’oxygène lors de l’imagerie par fluorescence de cellules vivantes^14,15. Le sulfite de sodium a été utilisé dans le traitement anaérobie des nématodes¹⁶ et, plus récemment, dans les protoplastes du riz, en conjonction avec des techniques telles que les tests d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)¹⁷. Les packs d’absorbeurs d’oxygène, principalement utilisés pour la culture bactérienne anaérobie¹⁸, ont également démontré leur efficacité à induire l’activation des promoteurs de ZmPORB1 dans les protoplastes de maïs dans des conditions anaérobies¹⁹.

Le présent travail vise à établir un pipeline robuste pour l’isolement et l’expression transitoire des protoplastes du chou. Par la suite, l’efficacité de divers traitements d’ajustement de l’oxygène a été évaluée en évaluant l’activité promotrice des gènes de réponse anaérobie à l’aide de tests à double luciférase. Le protocole élaboré dans le cadre de cette étude devrait être utile pour les recherches futures sur le stress de submersion ou d’hypoxie dans les systèmes de Brassica.

Protocole

Deux cultivars commerciaux de chou (B. oleracea var. capitata) ont été utilisés dans cette étude : 'Fuyudori' et '228'. Une représentation graphique du flux de travail du protocole est illustrée à la figure 1. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des plants de chou

1. Semez les graines de chou 'Fuyudori' et '228' à l’aide d’un substrat végétal commercial dans des trous ronds de forme carrée (P 4,5 cm x H 4,5 cm) de plateaux à 48 puits (L 49 cm x L 28 cm x H 5 cm). Enfoncez les graines à environ 1 cm de profondeur dans le milieu de culture.
2. Cultivez les plants de chou dans une salle de culture à 22 °C avec un cycle lumière-obscurité de 16/8 h. Maintenez l’intensité lumineuse de 100 μmol ^m-2·^s-1 (tube fluorescent blanc) pendant la phase d’éclairage.
3. Après 2-3 semaines de croissance, utilisez des plants de chou au stade 2 feuilles pour une meilleure isolation des protoplastes du mésophylle.
   REMARQUE : La taille suggérée des semis de chou est un stade à 2 feuilles, au cours duquel la deuxième vraie feuille est complètement développée, mais la troisième vraie feuille n’est pas élargie et sa longueur est inférieure à 1 cm (figure 2A). Pour synchroniser les stades de développement des plants de chou, les graines de 'Fuyudori' doivent être semées environ 2 jours plus tôt que celles de '228' en raison de leurs vitesses de croissance différentes. Cet ajustement assure une croissance et une maturité uniformes parmi les plants de chou au stade souhaité.

2. Isolement des protoplastes du chou

1. Préparer 12,5 mL de solution enzymatique (tableau 1) avant chaque isolement de protoplastes.
   1. Préchauffer une solution avec 10 mM de MES (pH 5,7) et 0,6 M de mannitol à 55 °C. Continuez à réchauffer la solution à 55 °C pendant 10 min après avoir ajouté 1,5 % de cellulase R10 et 0,75 % de macérozyme R10.
   2. Une fois que la solution enzymatique a refroidi à température ambiante (25 °C), ajoutez 10 mM de CaCl₂ et 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA). Stérilisez la solution enzymatique préparée dans une boîte de Pétri de 9 cm à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
      REMARQUE : Le préchauffage de la solution augmente la solubilité de l’enzyme et inactive la protéase. Les effets de la digestion varient en fonction des différents types d’enzymes cellulases. L’association de Cellulase R10 et de Macerozyme R10 convient à l’isolement des protoplastes du chou.
2. Récupérez les deuxièmes vraies feuilles nouvellement développées de cinq à huit plants de chou et coupez-les en lanières de 0,5 à 1,0 mm à l’aide d’une lame de rasoir tranchante. Transférez immédiatement les bandes de feuilles dans la solution enzymatique fraîchement préparée.
   REMARQUE : Il est crucial de sélectionner des feuilles saines et désignées du chou au bon stade. Les deuxièmes vraies feuilles nouvellement développées à partir de semis de chou au stade 2 feuilles offrent la plus grande efficacité d’isolation des protoplastes. Les plantes trop matures, les cotylédons ou les feuilles âgées ne sont pas recommandés pour l’isolement des protoplastes. Cinq à douze vraies feuilles bien développées peuvent produire des protoplastes de chou dans 12,5 ml de solution enzymatique. Le nombre de feuilles nécessaires à l’isolement des protoplastes dépend de la quantité souhaitée de protoplastes nécessaires. En règle générale, les protoplastes obtenus à partir de cinq à huit feuilles sont suffisants pour les procédures expérimentales ultérieures.
3. Après une infiltration sous vide dans l’obscurité pendant 30 minutes (figure 2B), maintenez les lamelles de chou immergées dans la solution enzymatique (figure 2C) dans l’obscurité à température ambiante pendant 4 à 16 heures supplémentaires.
   REMARQUE : Le temps de digestion enzymatique peut varier entre les cultivars de chou et doit être optimisé en fonction du génotype spécifique. Par exemple, 'Fuyudori' nécessite un temps de digestion plus long (16 h) que '228' (4 h) en raison de l’épaisseur plus épaisse des feuilles de 'Fuyudori'.
4. Diluer la solution contenant des protoplastes avec un volume égal de solution W5, qui se compose de 2 mM de MES (pH 5,7), 154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl₂, 5 mM de KCl et 5 mM de glucose (voir le tableau 1 pour la préparation), pour arrêter la digestion enzymatique.
5. Libérez la suspension du protoplast en tourbillonnant doucement ou à l’aide d’un agitateur orbital. Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 70 μm dans un tube conique de 50 mL.
   REMARQUE : Les protoplastes isolés peuvent passer à travers une crépine cellulaire de 70 μm, tandis que les débris végétaux non digérés sont retenus par la crépine et ensuite retirés de la suspension. Les crépines à cellules peuvent être réutilisées et conservées dans de l’éthanol à 75 % après le lavage, mais il est nécessaire de rincer complètement les crépines à cellules avec une solution W5 pour éliminer l’éthanol résiduel avant utilisation.
6. Centrifuger la solution de protoplastes avec 150 x g pendant 2 min à 4 °C, puis retirer délicatement le surnageant. Lavez délicatement les protoplastes granulés en ajoutant 10 mL de solution W5 le long de la paroi du tube conique à un débit approximatif de 1 mL·^s-1. Centrifugez le tube à 150 x g pendant 2 min à 4 °C et répétez cette procédure de lavage pour assurer l’élimination complète de la solution enzymatique.
7. Remettez les protoplastes en suspension dans la solution W5 et placez-les sur de la glace pendant 30 min. Après l’incubation dans la glace, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette 1 mL à la fois jusqu’à ce que tout le surnageant soit retiré.
8. Remettre les protoplastes en suspension dans une solution de MMG pré-refroidie composée de 4 mM de MES (pH 5,7), 0,4 M de mannitol et 15 mM de MgCl₂ (voir le tableau 1 pour la préparation).
9. Mesurez la concentration de protoplastes à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la concentration finale à 4 x 10⁵ protoplastes·^mL-1 à l’aide d’une solution MMG.

3. Transfection des protoplastes

1. Mélanger un volume total de 10 μL de plasmide (5-10 μg) (Fichier supplémentaire 1) avec 100 μL de protoplastes (4 x 10^{4 protoplastes} ) et placer sur de la glace pendant 10 min.
   REMARQUE : Pour la purification de plasmide de qualité transfection, un kit plasmidique disponible dans le commerce est utilisé en suivant les instructions du fabricant. Environ 4 x 10⁴ protoplastes sont généralement utilisés dans un test de rapporteur à double luciférase. Pour les expériences à plus grande échelle, une plus grande quantité de protoplastes est disponible pour la transfection. Plus précisément, environ 2 x 10⁵ protoplastes transfectés avec 10 μg de plasmide présentent une efficacité de transfection prouvée allant de 30 % à 40 %.
2. Ajouter un volume égal (110 μL) de solution de PEG fraîchement préparée (voir le tableau 1 pour la préparation) contenant 40 % de polyéthylène glycol 4000 (PEG4000), 0,1 M de CaCl₂ et 0,2 M de mannitol dans la solution de protoplaste et mélanger délicatement.
3. Incuber le mélange de protoplastes à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 min, puis ajouter 440 μL de solution W5 pour terminer la réaction.
4. Centrifuger les protoplastes transfectés à 150 x g pendant 2 min à 4 °C et remettre la pastille en suspension dans 750 μL de solution W5 enrichie en oxygène. Transférez les protoplastes remis en suspension dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits pré-enduite de 1 % de BSA.
   REMARQUE : La solution W5 utilisée pour l’incubation cellulaire doit être remplie de bulles d’oxygène à l’aide d’un concentrateur d’oxygène (~90 % d’oxygène) relié à une pierre à air pendant 5 minutes (Figure 2D). Suite à ce processus d’oxygénation, la concentration finale d’oxygène dissous dans la solution W5 est passée de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 à 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, mesuré à l’aide d’un oxygénomètre dissous. Le volume de la solution W5 pour la remise en suspension du protoplaste transfecté dépend du type de plaque de culture cellulaire tissulaire utilisée. Pour les plaques de culture cellulaire à 12 ou 24 puits, il est conseillé de réduire le volume de la solution W5 pour atténuer le stress d’hypoxie pendant l’incubation en raison de la profondeur plus profonde dans les puits. Pour l’enrobage BSA, chaque puits de la plaque de culture a reçu 1 mL de solution BSA à 1 %, qui a été laissé enrober les puits pendant 10 s. La solution BSA a ensuite été éliminée de chaque puits, et les puits ont ensuite été remplis à nouveau avec de la solution W5. Cette procédure visait à créer une surface temporaire non adhérente à l’aide de BSA, empêchant efficacement les protoplastes de coller à la surface plastique de la plaque de culture lors des étapes expérimentales ultérieures.

4. Traitement de l’hypoxie sur les protoplastes du chou

1. Effectuez des traitements d’hypoxie d’origine chimique ou physique immédiatement après la transfection du protoplaste.
   REMARQUE : Il est recommandé d’appliquer le traitement par hypoxie immédiatement après la transfection du protoplaste. L’incubation prolongée des protoplastes peut diminuer la réponse d’hypoxie ultérieure.
   1. Pour l’hypoxie induite chimiquement sur les protoplastes du chou, ajoutez de l’OxyFluor, de l’EC-Oxyrase et du sulfite de sodium à la solution de protoplaste W5.
      REMARQUE : L’utilisation de 0,6 unité·^{mL-1 EC-oxyrase} , de 0,6 unité·^mL-1 d’OxyFluor et de 1 g·^mL-1 de sulfite de sodium dans W5 a été les conditions testées capables d’induire le promoteur BoADH1 et BoSUS1L (figure 3A) avec de faibles dommages à l’intégrité des protoplastes dans les deux variétés de chou examinées.
   2. En cas d’hypoxie induite par un sac de consommation d’oxygène, placez deux packs d’absorbeurs d’oxygène dans un bocal anaérobie de 3,5 L pour créer un environnement hypoxique.
2. Récoltez les protoplastes traités à l’hypoxie par centrifugation à 150 x g pendant 2 min à 4 °C. Congelez les protoplastes collectés à l’aide d’azote liquide et stockez-les dans un congélateur à -80 °C pour les tests ultérieurs.

5. Double dosage de la luciférase

1. Effectuez le test de rapporteur à double luciférase conformément aux instructions du fabricant, avec des modifications mineures.
   1. Remettre en suspension les protoplastes de chou dans 50 μL de 1x tampon de lyse passive et vortex pendant 10 s.
   2. Incuber des protoplastes perturbés sur de la glace pendant 10 min et recueillir le surnageant après centrifugation à 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
   3. Ajouter 20 μL de lysat cellulaire dans chaque puits de la microplaque. Versez 100 μL de réactif de dosage de la luciférase II dans les puits et mesurez l’activité de la luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques.
   4. Ajouter 100 μL du réactif d’essai disponible dans le commerce dans chaque puits et mesurer l’activité de la Renilla luciférase à l’aide d’un lecteur de microplaques.

Résultats

Ce travail a permis de développer un système d’expression transitoire utilisant des protoplastes de chou (voir la figure 1 pour le flux de travail). Des protoplastes ont été isolés chez des vraies feuilles de chou de 2 à 3 semaines de taille appropriée (figure 2A) chez des cultivars commerciaux de chou 'Fuyudori' et '228' par digestion cellulase/macérozyme et par infiltration sous vide foncé (figu...

Discussion

Ce protocole présente une méthode simplifiée pour l’isolement des protoplastes à partir de deux cultivars de chou commerciaux. L’efficacité de cette méthode est principalement évaluée à l’aide de deux paramètres critiques de contrôle de la qualité : le rendement des protoplastes viables et l’efficacité de la transfection des protoplastes. La mise en œuvre de ce protocole a permis d’obtenir un rendement supérieur à 4,00 x 10⁶ protoplastes·g⁻¹

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-morpholino) ethanesulfonic Acid (MES)	PhytoTech Labs	M825	For enzyme solution preparation
228 cabbage seeds	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japan)
50 mL Conical Tube	SPL Life Sciences	50050	For enzyme solution preparation
6-well tissue culture plate	Alpha Plus	16106	For protoplast incubation
70 μm cell strainer	Sorfa	SCS701	For protoplast filtration
9-cm Petri dish	Alpha Plus	16001	For enzymatic digestion
Anaerobic jar	HIMEDIA	Anaerobic Jar 3.5 L	For hypoxia treatment
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906	For W5 solution preparation and culture plate coating
Calcium chloride	J.T.Baker	131301	For W5 solution and PEG solution preparation
Cellulase R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Desiccator	Tarsons	402030	For vacuum infiltration
D-Glucose	Bioshop	GLU501	For W5 solution preparation
Dissolved oxygen meter	Thermo Scientific	Orion Star A223	For oxygen measurement
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	For enzyme solution, PEG solution, and MMG solution preparation
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1960	For Dual-luciferase reporter assay
EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	For hypoxia treatment
Fuyudori cabbage seeds	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japan)
High-Speed refrigerated centrifuge	Hitachi	CR21GIII	For protoplast harvest
Macerozyme R10	Yakult		For enzyme solution preparation
Magnesium chloride	Alfa Aesar	12315	For MMG solution preparation
Microcentrifuge	Hitachi	CT15RE	For protoplast harvest
Microplate	Greiner	655075	For Dual-luciferase reporter assay
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax Mini	For Dual-luciferase reporter assay
Millex 0.22 μm syringe filter	Merck	SLGP033RS	For enzyme solution preparation
Oil Free Vacuum Pump	Rocker	Rocker 300	For vacuum infiltration
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	For hypoxia treatment
Oxygen absorber pack	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	For hypoxia treatment
Oxygen concentrator	UTMOST PERFECT	AII-X	For oxygen-bubbling in W5 solution
Plant substrate	Klasmann-Deilmann	Potgrond H substrate	For cabbage seedlings preparation
Plasmid Midi Kit	QIAGEN	12145	For purification of transfection-grade plasmid DNA
Polyethylene Glycol 4000	Fluka	81240	For protoplast transfection
Potassium chloride	J.T.Baker	304001	For W5 solution preparation
Razor blade	Gillette		For cabbage leaf strips preparation
Sodium chloride	Bioshop	SOD002	For W5 solution preparation
Sodium sulfite	Sigma-Aldrich	S0505	For hypoxia treatment
Water Bath	Yihder	BU-240D	For enzyme solution preparation