Test d’efficacité de traduction à l’aide de profils polysomiques sous contrainte thermique

Résumé

Le protocole présenté ici implique un profilage polysomal pour isoler le translatome, ARNm associé aux ribosomes, en ARN non polysomiques et polysomiques d’Arabidopsis par centrifugation à gradient de densité de saccharose. Cette méthode démontre l’efficacité de traduction d’Arabidopsis soumis à un stress thermique.

Résumé

Le contrôle translationnel de différents gènes en stress thermique est une étape critique pour l’adaptation des plantes à l’environnement. L’évaluation des activités translationnelles de divers gènes peut nous aider à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à la résilience des plantes, contribuant ainsi au développement de cultures avec une tolérance accrue au stress face au changement climatique mondial. Cet article présente une méthodologie détaillée pour évaluer l’efficacité de la traduction par profilage des polysomes dans les plantes exposées à un stress thermique. La procédure est divisée en trois parties : le traitement du stress thermique pour Arabidopsis, le test d’efficacité de traduction à l’aide de profils de polysomes et le calcul de l’efficacité de traduction en isolant les ARN non polysomiques et polysomaux en fonction du profil. Dans la première partie, les plantes d’Arabidopsis sont soumises à des conditions de stress thermique contrôlé pour imiter les défis environnementaux. Le traitement consiste à exposer les plantes à des températures élevées pendant des durées déterminées, assurant une induction de stress constante et reproductible. Cette étape est cruciale pour étudier les réponses physiologiques et moléculaires de la plante au stress thermique. La deuxième partie implique le test d’efficacité de traduction à l’aide du profilage des polysomes. Les polysomes sont extraits par centrifugation par gradient de saccharose, qui sépare les ARNm en fonction de la charge ribosomique. Cela permet d’examiner l’occupation des ribosomes sur les ARNm, ce qui donne un aperçu des mécanismes de contrôle traductionnel dans des conditions de stress. Dans la troisième partie, l’ARN est isolé à partir de fractions polysomiques et non polysomiques. L’ARN de pointe est utilisé pour mesurer avec précision la quantité d’ARN dans chaque fraction. Le calcul de l’efficacité de traduction est effectué en comparant la distribution des ARNm à travers ces fractions dans des conditions normales et de stress thermique. Les activités de traduction de gènes spécifiques sont évaluées en effectuant une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) avec de l’ARN associé aux ribosomes et de l’ARN total. Cette méthodologie se concentre exclusivement sur les effets du stress thermique, fournissant un protocole détaillé pour l’analyse de la régulation translationnelle chez les plantes.

Introduction

La traduction est cruciale pour que les organismes synthétisent des protéines fonctionnelles à partir de l’ARNm, soutenant les fonctions cellulaires essentielles et les processus biologiques tels que le métabolisme et la signalisation et permettant les réponses au stress. Sans traduction, les cellules ne peuvent pas produire de protéines vitales, ce qui a un impact sur leur structure, leur fonction et leur régulation, affectant ainsi le maintien de la vie et favorisant la diversité biologique ^1,2. Par conséquent, l’étude de l’efficacité translationnelle des plantes est cruciale. La traduction comporte plusieurs étapes essentielles. Tout d’abord, l’initiation se produit lorsque l’ARNm se lie à un ribosome, facilitée par des facteurs d’initiation tels que les eIFs chez les eucaryotes, qui identifient le codon de départ, généralement AUG. Ensuite, l’élongation se produit lorsque les molécules d’ARN de transfert (ARNt), chacune portant des acides aminés spécifiques, se lient séquentiellement au ribosome. Des liaisons peptidiques se forment entre les acides aminés adjacents, allongeant la chaîne polypeptidique en fonction de la séquence de l’ARNm. Enfin, la terminaison est initiée lors de la rencontre d’un codon d’arrêt (UAA, UAG ou UGA), reconnu par des facteurs de libération qui incitent le ribosome à libérer la protéine nouvellement synthétisée. Tout au long de la traduction, divers facteurs d’initiation eucaryotes (eIF), facteurs d’élongation et ARN ribosomales travaillent ensemble pour assurer la précision et l’efficacité ^3,4.

Des études antérieures ont indiqué que les modifications post-traductionnelles jouent un rôle essentiel dans la régulation des interactions entre les eFI et influencent ainsi l’efficacité de la traduction. Des recherches in vitro ont révélé que la kinase CASEIN KINASE 2 (CK2) phosphoryle eIF3c, eIF5 et eIF2β pour augmenter leurs interactions entre elles et avec eIF1 ^5,6. Dans l’obscurité, la ligase E3 CONSTITUTIVEMENT PHOTOMORPHOGÉNIQUE 1 (COP1) réprime la traduction en inhibant la phosphorylation de S6K-RPS6 médiée par TOR. Le RPS6 non phosphorylé est incapable de former des ribosomes fonctionnels, arrêtant ainsi la traduction⁷. À l’inverse, dans des conditions de luminosité, la kinase SUPPRESSOR OF PHYA 105 (SPA1) phosphoryle eIF2α pour faciliter l’assemblage du complexe eIF2 et favoriser l’initiation de la traduction⁸. Ces résultats mettent en évidence les mécanismes de contrôle complexes qui régulent la traduction en réponse aux signaux environnementaux.

Des stimuli environnementaux modérés peuvent favoriser efficacement les processus de traduction pour faciliter la croissance, tels que la photomorphogenèse ^8,9. Cependant, lorsque les facteurs environnementaux sont excessifs, les usines immobiles doivent mettre au point des mécanismes de régulation appropriés pour atténuer les dommages causés par le stress environnemental¹⁰. Dans des études antérieures portant sur les réponses au stress des plantes, la majorité s’est concentrée sur la régulation aux niveaux métabolique, hormonal et transcriptionnel 11,12,13,14. Cependant, des recherches récentes ont commencé à mettre en évidence l’influence de la régulation translationnelle sur la tolérance au stress des plantes 15,16,17. Les plantes peuvent augmenter leur tolérance au stress en réduisant l’efficacité de traduction, minimisant ainsi la consommation d’énergie inutile. En raison de la formation de granules de stress non membraneux dans les cellules végétales, l’ARNm non traduit et les protéines associées s’y agrègent pour réduire l’efficacité de la traduction¹⁸. L’un des stress environnementaux courants auxquels les plantes sont souvent confrontées est le stress thermique, qui induit la formation de granules de stress dans les cellules végétales^19,20. L’augmentation mondiale des températures moyennes due au réchauffement climatique affecte gravement les rendements des cultures²¹. Par conséquent, l’étude de la régulation physiologique des plantes sous stress thermique est cruciale. Une étude antérieure a montré que le traitement thermique du blé entraînait une diminution de l’ARNm lié aux polysomes. Cependant, les ARNm stockés dans les granules de stress ont été libérés et reliés aux ribosomes, facilitant la traduction après la récupération²². De plus, des recherches antérieures ont comparé l’expression génique entre l’ARNm total et l’ARNm lié aux polysomes dans des plantes submergées¹⁶. Les résultats ont indiqué que les niveaux d’ARNm à l’état d’équilibre associés aux réponses d’acide abscissique et de stress abiotique ont légèrement augmenté après l’immersion. De plus, la quantité d’ARNm liés aux polysomes a considérablement augmenté. Ces résultats suggèrent que la régulation de la traduction pourrait jouer un rôle plus critique dans le contrôle de la tolérance au stress chez les plantes. Par conséquent, une méthode efficace d’isolement de l’ARN polysomal est cruciale pour étudier le translatome des échantillons traités au stress.

Dans ce protocole, nous avons modifié la méthode d’isolement de l’ARN de la méthode d’extraction phénol/chloroforme à haut risque et volumineuse avec précipitation LiCl à la méthode d’extraction à petite échelle du thiocyanate de phénol/guanidinium, qui nécessite moins de volume. La première méthode implique un mélange direct avec des fractions polysomales, ce qui permet d’obtenir des déchets expérimentaux plus volumineux ^9,15,23. En revanche, cette approche modifiée utilise les principes de densité différentielle : l’ARN polysomal est d’abord mélangé à une solution riche en sel et sans sucre, puis précipité par ultracentrifugation. Par la suite, l’extraction de l’ARN est réalisée à l’aide d’un petit volume de réactif de thiocyanate de phénol/guanidinium. Cette méthode réduit efficacement la production de déchets organiques, ce qui rend notre expérience plus respectueuse de l’environnement. De plus, les solvants organiques utilisés ont une toxicité plus faible. Ces raisons nous ont amenés à ajuster et à améliorer les procédures expérimentales en conséquence. De plus, les méthodes précédentes ne fournissaient pas de protocole complet pour calculer l’efficacité de la traduction à l’aide de la normalisation de pointe, ce qui est essentiel pour des analyses translatomiques plus approfondies.

Ici, nous décrivons le profilage des polysomes et le protocole d’isolement de l’ARN polysomal pour étudier l’efficacité de la traduction et les analyses translatomiques chez Arabidopsis sous stress de choc thermique. Ce protocole a été utilisé pour évaluer l’efficacité de la traduction chez le type sauvage Col-0 dans des conditions normales, de choc thermique et de post-récupération. Les résultats du profilage des polysomes et le pourcentage d’ARN polysomique ont révélé des altérations de l’efficacité de la traduction après un traitement de stress thermique chez les plantules d’Arabidopsis .

Protocole

1. Préparation de l’échantillon de semis d’Arabidopsis traités au stress thermique

1. Plaquez 250 graines pour chaque répétition et chaque condition avec un compte-gouttes sur le papier filtre placé sur la plaque de gélose de milieu basal Murashige et Skoog (MS) sans saccharose (pH 5,6) complétée par 1,2 % de phytoagar.
   REMARQUE : Pour planter des semis sur des plaques MS, du papier filtre stérile est placé sur la plaque pour empêcher les racines des semis de pénétrer profondément dans le milieu, facilitant ainsi l’échantillonnage. Les graines sont ensuite plantées sur le papier filtre. Pour exclure l’influence des sucres sur la croissance des plantes et les résultats expérimentaux, il est recommandé d’utiliser un milieu MS qui ne contient pas de saccharose pour la culture.
2. Enveloppez la plaque MS contenant les graines plantées avec du papier d’aluminium pour bloquer la lumière et incubez-la à 4 °C pendant 2 jours pour induire la vernalisation.
3. Transférez les graines vernalisées dans une chambre de croissance pour les faire pousser sous une photopériode clair-foncé de 16 h : 8 h à 22 °C avec une intensité lumineuse de 100 μmol/m²/s.
4. Pour les échantillons de stress thermique, scellez les plaques de milieu MS contenant des plantules de 5 jours avec du ruban adhésif imperméable et placez-les dans un bain-marie à 40 °C pendant 1 h.
5. Pour les échantillons récupérant après le traitement thermique, refroidissez les plaques immédiatement après le traitement thermique. Par la suite, placez-les dans une chambre de croissance à 22 °C pendant 2 h.
6. Récoltez 250 semis, traités ou non, dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pour chaque répétition et congelez immédiatement les échantillons dans de l’azote liquide.
   REMARQUE : Pour chaque condition, deux groupes d’échantillons ont été préparés. L’une est destinée aux analyses de profilage de polysomes, et l’autre à l’extraction d’ARN non polysomiques et polysomiques.

2. Préparation du gradient de saccharose

1. Préparez la solution de gradient contenant les concentrations suivantes de saccharose : 12,5 %, 24,4 %, 36,3 %, 48,1 % et 60 %. La composition de la solution comprend 50 mM de Tris-HCl, 25 mM de KCl, 10 mM de MgCl₂, 100 μg/mL d’héparine et 50 μg/mL de cycloheximide (CHX).
2. Chargez les solutions de gradient de haute à faible concentration, en commençant par le bas et en allant vers le haut. Après avoir ajouté chaque concentration de solution de gradient, congelez la solution à l’état solide avant d’ajouter la concentration suivante. Pour chaque concentration de gradient de saccharose, ajouter 2,2 mL. Ce processus se traduira par un gradient de densité discontinu de saccharose.
3. Conservez temporairement le gradient de saccharose préparé à -80 °C et décongelez-le pendant une nuit à 4 °C avant utilisation.

3. Préparation d’échantillons de profilage de polysomes

1. Broyer 250 semis de Col-0 âgés de 5 jours, qu’ils aient été soumis à un stress thermique ou non, qui ont été préalablement congelés en poudre à l’aide d’un homogénéisateur à une fréquence de 30 cycles/s pendant 1 min.
   REMARQUE : Lorsque le nombre de plantes avec le même arrière-plan est égal, elles ont le même rendement d’extraction d’ARN. Cependant, lorsque l’on compare des plantes transgéniques ou mutantes surexprimant avec des origines différentes, la quantité de plantes utilisées doit être ajustée en fonction des conditions de la plante.
2. Pour obtenir une solution d’extraction contenant de l’ARN non polysomique et polysomique, ajoutez 500 μL de tampon d’extraction de polysomes (200 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM de KCl, 25 mM de MgCl₂, 50 μg/mL de cycloheximide, 100 μg/mL d’héparine, 2 % de PTE, 10 % de COD, 400 U/mL d’inhibiteur de ribonucléase) dans chaque tube, et mélangez les échantillons en inversant et en vortexant. S’assurer que les échantillons sont maintenus à 4 °C tout au long du processus.
3. Centrifuger la solution d’extraction à 4 °C, 12 000 x g pendant 10 min. Ensuite, filtrez le surnageant à travers une crépine cellulaire de 100 μm pour obtenir une solution d’extraction claire et sans particules.
   REMARQUE : Les particules présentes dans la solution d’extraction peuvent se sédimenter pendant l’ultracentrifugation, formant potentiellement une pastille qui pourrait affecter la précision des mesures de profilage des polysomes.
4. Chargez le surnageant filtré sur un gradient de saccharose pré-préparé et assurez-vous qu’il atteint l’équilibre.
   REMARQUE : En raison de la vitesse de rotation élevée de l’ultracentrifugeuse, il est essentiel d’assurer à la fois la sécurité et le bon fonctionnement de l’ultracentrifugeuse. Pour y parvenir, il est nécessaire de confirmer que les poids de l’échantillon sont identiques avant la rotation. Par conséquent, nous utilisons une balance de précision pour vérifier que les poids des pentes sont complètement uniformes.
5. Centrifuger le gradient de saccharose chargé d’échantillons à 4 °C, 210 000 x g pendant 3,5 h à l’aide d’un rotor à godet oscillant ultracentrifuge. Réglez les taux d’accélération et de décélération au maximum. Après ultracentrifugation, les ARN non polysomiques et polysomaux sont répartis en fonction de leur densité dans la solution de gradient de saccharose correspondante.
   REMARQUE : Dans le gradient de saccharose, l’ARN non polysomique de faible densité se distribue dans la couche supérieure, tandis que l’ARN polysomal, caractérisé par une densité plus élevée en raison de la présence de nombreux ribosomes engagés dans la traduction active sur l’ARNm, se distribue dans la couche inférieure. Par la suite, le profilage des polysomes peut être mesuré à l’aide d’un fractionneur de gradient de densité.

4. Analyse du profilage des polysomes

REMARQUE : Un fractionneur à gradient de densité avec une pompe à seringue à microvolume est utilisé pour mesurer le profilage des polysomes.

1. Préparez la solution de chasse (70 % de saccharose, 10 % de glycérol et 0,02 % de bleu de bromophénol) pour le pousse-seringue à microvolume.
2. Utilisez un logiciel pour contrôler le fractionneur de gradient de densité. Calibrez la machine à l’aide d’eau déminéralisée. Après l’étalonnage, utilisez-le pour effectuer le profilage des polysomes.
   1. Pour effectuer le réglage de la ligne de base, allumez l’UV/VISDetector jusqu’à ce que le voyant passe du rouge au vert. Ajustez le bouton Recorder Offset pour aligner la ligne de marqueur, puis tournez le bouton Baseline Adjust sur la position d’ouverture minimale. Réglez le bouton de sensibilité du détecteur UV/VISDETECTOR sur le niveau 2.0 et appuyez sur le bouton Auto Baseline . Enfin, utilisez le bouton Recorder Offset pour régler la ligne de base souhaitée à 20. Le processus d’étalonnage variera en fonction de la marque du mécanisme et des différents échantillons.
3. Après l’ultracentrifugation, placez les tubes contenant les échantillons sur le fractionneur à gradient de densité à l’aide du système de perçage de tube afin que le tube puisse être connecté à la pompe à seringue avec la solution de poursuite et le détecteur UV.
4. Basculez le fractionneur de gradient de densité en mode de commande logiciel (REMOTE) et réglez le débit d’injection de la pompe à seringue à microvolume à 3 mL/min.
5. Lancez les paramètres du logiciel pour commencer et obtenir le graphique de profil des polysomes à l’aide du fractionneur en mesurant OD₂₅₄.

5. Isolement d’ARN non polysomiques et polysomiques

REMARQUE : Pour cette partie du protocole, un groupe différent d’échantillons du même lot a été utilisé après avoir effectué l’ultracentrifugation en suivant les mêmes étapes que celles décrites précédemment.

1. Sur la base des résultats de mesure du profil des polysomes, collectez séparément les fractions d’ARN non polysomiques et polysomiques. Calculer les volumes de solution pour les fractions non polysomiques et polysomiques et recueillir la fraction non polysomale (partie supérieure).
   REMARQUE : Selon les profils, la fraction avec plus de deux ribosomes est définie comme une fraction polysomale, tandis que la fraction avec les pics d’ARNr 40S, 60S et 80S est définie comme une fraction non polysomale.
2. Mélangez soigneusement les fractions cibles d’ARN avec une solution pré-froide 2x à haute teneur en sel (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl₂).
3. Ajouter 8 μL de stock dilué d’ARN poly-A eucaryote de contrôle à partir du kit.
   REMARQUE : Pour la normalisation du pic requis pour la septième étape. Le kit de contrôle de l’ARN poly-A eucaryote comprend des gènes de B. subtilis , tels que le gène DAP qui ne sont pas présents chez les plantes, comme gènes de référence. Pour déterminer la proportion de perte du gène de référence au cours de la réaction après l’extraction, ajoutez une quantité égale du réactif contenant un échantillon d’ARN du gène DAP dans différents tubes avec de l’ARN non polysomique ou polysomique avant l’extraction. Cela permet de déterminer la proportion de perte de gène de référence au cours de la réaction après l’extraction et peut être utilisé à des fins de normalisation.
4. Centrifuger la solution à haute teneur en sel à 4 °C, 450 000 x g, pendant 5 h à l’aide d’un rotor à godet oscillant d’ultracentrifugeuse.
5. Après l’ultracentrifugation, l’ARN va précipiter au fond du tube de centrifugation. Versez soigneusement le surnageant par le haut pour préserver la pastille d’ARN au fond.
6. Lavez rapidement la pastille d’ARN avec 500 μL d’eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC) pré-froide, en répétant cette étape 3 fois.
   REMARQUE : Pour éviter que l’eau traitée au DEPC ne dissout à nouveau l’ARN pendant le processus de lavage, il est nécessaire de pré-refroidir l’eau traitée au DEPC avant utilisation afin de réduire sa solubilité. De plus, le temps de contact entre l’eau traitée au DEPC et la pastille d’ARN pendant le lavage doit être minimisé.

6. Extraction d’ARN non polysomique et polysomal

1. Ajouter 500 μL de réactif d’extraction d’ARN et mélanger avec l’échantillon d’ARN à extraire. Incuber pendant 10 min.
2. Ajouter 100 μL de chloroforme, bien mélanger et incuber pendant 10 minutes pour la séparation des phases.
3. Centrifuger le mélange réactionnel à 4 °C, 12 000 x g pendant 10 min. Transférez la couche aqueuse transparente supérieure contenant de l’ARN dans un nouveau tube, mélangez-la doucement avec un volume égal d’isopropanol et incubez à -20 °C pendant 2 h pour la précipitation de l’ARN.
4. Après les précipitations, centrifuger à 4 °C, 12 000 x g pendant 10 min. Jetez soigneusement le surnageant et conservez la pastille d’ARN au fond.
5. Lavez la pastille d’ARN avec 1 ml d’éthanol à 75 % pré-froid. Centrifugez à 4 °C, 12 000 x g pendant 10 min, jetez le surnageant et faites sécher la pastille d’ARN à l’air.
6. Une fois la pastille d’ARN séchée, la remettre en suspension dans 30 μL d’eau traitée au DEPC et mesurer la concentration d’ARN (OD₂₆₀) à l’aide d’un spectrophotomètre à spectre complet (220 nm-750 nm).

7. Normalisation du pic de puissance

1. Utilisez 1000 ng d’ARN extrait pour la transcription inverse effectuée à l’aide d’un kit qPCR en suivant les instructions du fabricant. Les ARN non polysomiques et polysomiques doivent être transcrits inversement en ADNc.
2. Mélangez 1 μL d’ADNc avec des amorces de gène DAP et utilisez le tampon SYBR pour mesurer le niveau d’expression du gène cible conformément aux instructions du fabricant. Ensuite, utilisez la PCR en temps réel pour détecter l’expression du gène DAP .
   REMARQUE : Les séquences des amorces du gène DAP sont les suivantes :
   Amorce avant = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
   Amorce inverse = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
3. Comparer les niveaux d’expression des gènes DAP dans les groupes d’ARN non polysomiques et polysomaux mesurés et estimer la teneur en ARN dans des conditions de perte proportionnelle. À l’aide de la teneur en ARN normalisée, calculez le rapport de l’ARN dans les polysomes.

Résultats

Le type sauvage d’Arabidopsis, Col-0, a été cultivé sur un milieu MS sous une photopériode de lumière de 16 h : 8 h. Pour le contrôle, des semis âgés de 5 jours ont été utilisés sans traitement de stress thermique. Le groupe de stress thermique a subi 1 h de traitement thermique à 40 °C dans un bain-marie préchauffé, tandis que le groupe de récupération a été placé à 22 °C pendant 2 h immédiatement après le traitement thermique. En utilisant différente...

Discussion

Ce protocole décrit une méthode simple et standardisée pour mesurer l’efficacité de la traduction des semis d’Arabidopsis. Les étapes critiques de ce protocole sont d’assurer la stabilité de l’ARN avec la centrifugation secondaire et l’extraction du réactif d’extraction de l’ARN, ainsi que la préparation méticuleuse du gradient de saccharose. De plus, nous fournissons des étapes critiques pour normaliser et quantifier l’ARN non polysomal et polysomique avec la m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube	Labcon	3012-870-000-9	RNA extraction
13.2 mL centrifuge tube	Beckman Coulter	331372	ultracentrifugation
Bromophenol blue	Honeywell	32712	Polysome profile
Chloroform	Honeywell	32211	RNA extraction
Cycloheximide (CHX)	Sigma-Aldrich	SI-C7698	Polysome profile
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	D5758	RNA extraction
Ethanol	Sigma-Aldrich	32221	RNA extraction
GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit	Invitrogen	900433	Normalization
Glycerol	Honeywell	15523	Normalization
Heparin	Sigma-Aldrich	SI-H3149	Polysome profile
HiScript III RT SuperMix for qPCR kit	Vazyme	R323-01	Normalization
KCl	J.T.Baker	3040-01	Polysome profile
MgCl2	Sigma-Aldrich	SI-M8266	Polysome profile
MS basal medium	Phyto	M524	Plant culture
Peak Chart Syringe Pump	Brandel	SYN4007LS	Polysome profile
Polyoxyethylene-10-Tridecyl-Ether (PTE)	Sigma-Aldrich	P2393	Polysome profile
RNasin	Promega	N251B	Polysome profile
Sodium deoxycholate (DOC)	Sigma-Aldrich	SI-D6750	Polysome profile
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5391	Polysome profile
SYBR Green Supermix	Bio-Rad	BP170-8882	Normalization
TRI reagent	MRC	TR118	RNA extraction
Tris-HCl	J.T.Baker	4109-06	Polysome profile
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-100K	ultracentrifugation
UV/VISDETECTOR	Brandel	UA-6	Polysome profile