Vidéo: Adoptive Cell Transfer Technique

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Transfert adoptif de cellules : introduction de splénocytes d'une souris donneuse vers une souris hôte et évaluation du taux de succès au FACS

Vue d'ensemble

Source: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ Unité de lymphopoiesis, Département d'immunologie, Institut Pasteur, Paris, France
² INSERM U1223, Paris, France
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, France
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Institut Pasteur, Paris, France

Le transfert de cellules adoptives est une méthode pour introduire des cellules dans un patient ou un organisme d'étude afin de traiter une maladie ou d'étudier un processus biologique, tel que l'hématopoiesis. Les objectifs du transfert adoptif sont divers; il peut être utilisé en biologie fondamentale ainsi qu'en sciences médicales (1, 2). Dans les modèles murins, la migration et la distribution des cellules transférées peuvent être étudiées et suivies d'un système de suivi (marqueur de surface cellulaire, coloration par CFSE, etc.). Dans les études sur le cancer sur les modèles de souris, le transfert de populations cellulaires spécifiques peut être utilisé comme traitement expérimental contre les tumeurs. Un autre exemple pour cette technique est la création de souris chimériques par transfert de cellules de moelle osseuse à des souris irradiées ou des souris avec un phénotype d'immunodéficience grave. Ce modèle de souris peut être utilisé pour évaluer l'impact de la suppression des gènes sur une population cellulaire spécifique, par exemple. Le transfert des cellules d'emprunt d'os est également employé dans le traitement médical humain. Lorsque les patients sont irradiés en cas de traitement du cancer, le transfert adoptif de la moelle osseuse permet la reconstitution du système immunitaire.

La première étape de cette technique est d'obtenir la population cellulaire d'intérêt. La technique choisie pour isoler cette population dépend du niveau de spécificité de la population ciblée. Le plus grand niveau de sélection est l'organe entier, dans lequel toutes les populations cellulaires présentes dans l'organe sont prises. Une méthode plus précise est la sélection d'une population de cellules cibles, souvent sélectionnée par un marqueur de surface cellulaire. La méthode idéale pour trier les cellules dans ce cas est par tri magnétique. Enfin, le niveau le plus strict est le choix des cellules par plusieurs marqueurs de surface cellulaire pour trier des populations cellulaires très spécifiques. Le tri cytométrie de flux est la méthode la plus populaire pour ce niveau de sélection. Une fois que la population d'intérêt est obtenue, elle peut être transférée à l'hôte. Avant le transfert d'adoption, il est essentiel d'assurer la compatibilité entre l'hôte et le donateur. En effet, quel que soit l'objectif de transfert, la compatibilité est cruciale pour assurer l'adoption des cellules par l'hôte sans rejet de cellules.

Dans cet exercice de laboratoire, nous démontrons la technique de transfert de cellules adoptives en transférant des splenocytes d'une souris CD45.2 dans une souris CD45.1 Ragc (manquant de lymphocytes) et quatre jours plus tard confirment le transfert de splenocytes utilisant la cytométrie de flux (voir la figure 1 ).

Figure 1 : Représentation schématique du transfert adoptif. (1) Les splenocytes sont isolés des souris CD45.2 et (2) transférés dans la souris CD45.1 Ragôc, la souris de contrôle est injectée avec PBS seulement. (3) 4 jours après le transfert adoptif, les splenocytes sont récupérés des souris et (4) analysés par cytométrie de flux. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Procédure

1. Préparation

Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et les vêtements de protection appropriés.
Stériliser tous les outils de dissection, d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis sécher à fond.
Préparer 50 ml de la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).

2. Dissection

À l'aide d'un système de distribution de dioxyde de carbone, euthanasiez

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Résultats

Les souris de Ragc ont une composition altérée de système immunitaire, manquant principalement des lymphocytes. Le transfert adoptif des splenocytes permet l'introduction d'une population manquante comme les cellules T et B. Notre coloration comprenait des marqueurs de surface cellulaire CD45.1 et CD45.2 pour distinguer respectivement les cellules hôtes et donneurs (figure 2A). Il comprenait également d'autres marqueurs de surface cellul...

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Applications et Résumé

Le transfert d'adoption est une technique translationnelle dans différents domaines de la science, avec des applications en médecine. Cette technique peut être utilisée pour étudier la migration cellulaire et le tropisme ou l'incidence de carence en protéines dans des populations cellulaires spécifiques. Dans le dernier cas, différentes technologies peuvent être utilisées, en particulier les souris OGM où des populations cellulaires spécifiques sont intrinsèquement déficientes. Cependant, la construction g?...

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References

Restifo, N. P., Dudley, M. E. and Rosenberg., S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nature reviews. Immunology, 12 (4): 269-281, (2012).
Bonini, C., and Mondino, A. Adoptive T-cell therapy for cancer: The era of engineered T cells. European journal of immunology, 45 (9): 2457-69, (2015).

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1. Préparation

Avant de commencer, enfilez des gants de laboratoire et les vêtements de protection appropriés.
Stériliser tous les outils de dissection, d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis sécher à fond.
Préparer 50 ml de la solution de sel équilibrée de Hank (HBSS) contenant 2 % de sérum fœtal de veau (FCS).

2. Dissection

À l'aide d'un système de distribution de dioxyde de carbone, euthanasiez la souris par hypoxie. Fixez la souris euthanasiée sur une plaque de dissection en position de supine et effectuez une laparotomie longitudinale à l'aide de ciseaux et de forceps.
L'utilisation de forceps déplacer les intestins et l'estomac sur le côté droit de l'abdomen pour exposer l'estomac et la rate. La rate est attachée à l'estomac.
À l'aide de forceps, détachez soigneusement la rate de l'estomac et placez-la sur le plat Petri contenant 5 ml de HBSS 2% FCS.

3. Isolement des cellules immunitaires

Déposer la rate sur une passoire cellulaire de 40 m au-dessus du plat Petri. Écraser la rate avec un piston pour la dissocier.
Récupérer les cellules adhérentes en rinçant le piston et la passoire avec 1 ml de HBSS 2% FCS.
Transférer la rate dissociée et le liquide dans un tube centrifugeuse de 15 ml.
Laver le plat Petri avec 5 millilitres de HBSS 2% FCS et transférer le liquide dans le tube de 15 ml.
Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC et jeter le supernatant en évitant la pastille.
Resuspendre la pastille dans 2 ml de pipide de chlorure d'ammonium de potassium de haut en bas pour resuspendre la pastille et lyser les érythrocytes.
Attendez 2 min et ajoutez HBSS 2% FCS à la pastille remise en suspension pour obtenir le volume jusqu'à 14 ml.
Centrifuger le tube à nouveau à 370 x g pendant 7 min à 10oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille dans 5 ml de HBSS 2% FCS par pipetting de haut en bas.
Comptez les cellules à l'aide de l'essai de coloration bleu trypan et ajuster la concentration cellulaire finale à 10⁷ cellules/mL en utilisant le volume approprié de HBSS 2% FCS.

4. Transfert d'adoption

Transférer 2 ml de suspension cellulaire obtenue dans un tube de collecte de 5 ml.
Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC, puis jeter le supernatant.
Resuspendre la pastille dans 2 ml de PBS et centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC.
Jeter le supernatant et resuspendre les granulés dans 200 L de PBS.
À l'aide d'une seringue de 0,5 ml avec une aiguille de 29 G injecte 200 l de suspension cellulaire dans la souris expérimentale par voie intraveineuse dans le sinus sanguin rétro-orbital.
En tant que contrôle, injectez une deuxième souris dans le même sinus sanguin avec 200 l de phosphate tamponné salin.

5. Récolte et coloration des cellules

Quatre jours après le transfert d'adoption, euthanasiez les souris et enlevez la rate.
Récoltez les splenocytes tels que décrits à la section 3.
Transférer 100 l de suspensions cellulaires de chaque souris dans deux tubes FACS, étiquetés « contrôle » et « transféré ».
Centrifuger le tube à 370 x g pendant 7 min à 10oC, puis jeter les supernatants.
Préparer un mélange contenant les quatre anticorps aux dilutions énumérées dans le tableau 1.

Anticorps	Fluorochrome	dilution
CD45.1	BV711 (en anglais seulement)	1/200
CD45.2	APCCy7 (en anglais)	1/400
CD4 (en)	BV786 (en anglais seulement)	1/1600
CD3 (en)	BV421 BV421 (bv421)	1/200

Tableau 1 : Composition du mélange d'anticorps. Préparation de quatre cocktails d'anticorps utilisant des conjugates concentrés anticorps-fluorescents et HBSS.

Ajouter 100 l de mélange à chaque tube, puis couver pendant 20 min sur glace dans l'obscurité.
Ajouter 1 ml de HBSS 2%FCS, puis centrifuger les tubes à 370 x g pendant 3 min à 10oC.
Jetez les supernatants et suspendez les granulés dans 200 L de HBSS 2% FCS.
Transférer les cellules suspendues dans de nouveaux tubes FACS étiquetés.
L'utilisation de la cytométrie de flux, comme indiqué dans le protocole FACS, évaluer la présence de lymphocytes positifs CD45.2.

6. Analyse des données

Ouvrez le logiciel "FlowJo" et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre "All sample".
Double clic sur le fichier "transféré" pour afficher les cellules enregistrées à partir de cet échantillon sur une parcelle de point qui affiche la diffusion vers l'avant "SSC-A" sur l'axe Y et la diffusion latérale "FSC-A" sur l'axe X.
Cliquez sur «polygone» et créez une stratégie de gating pour sélectionner les lymphocytes, puis distinguez les cellules du donneur et de l'hôte à l'aide de marqueurs de surface cellulaire (CD45.1, CD45.2), puis caractérisent la population^de cellules CD45.2 (CD3, CD4).
Répétez les étapes d'analyse avec le fichier «souris de contrôle».
Pour visualiser une population cellulaire, cliquez sur "Layout editor".
Faites glisser les "cellules transférées" et les "cellules CD4 transférées" population de "transféré" et "contrôle" fichiers dans le " LayoutEditor tab".
Une parcelle de point représentant les cellules CD45.2^et les lymphocytes CD4 apparaîtra.
Les cellules transférées CD45.2 ne doivent apparaître que dans la parcelle de point «souris transférée».

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0:01

Concepts

2:26

Preparation of Materials

3:15

Dissection and Immune Cell Isolation

5:39

Adoptive Cell Transfer

6:35

Cell Harvest and Staining

8:04

Data Analysis and Results

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