Ce travail a été soutenu par l&#39;Australian Research Council matériel d&#39;infrastructure de liaison et accorder des facilités et des LEO668421 Australian Research Council Linkage Grant Project LP0669471. Les auteurs remercient la collaboration de l&#39;Institut de Technologie de Kanazawa et Yokogawa Electric Corporation en instituant le Laboratoire KIT-Macquarie recherche sur le cerveau.

Ces lignes directrices décrivent l&#39;équipement et des procédures pour mesurer la fonction cognitive du cerveau à l&#39;âge préscolaire en utilisant la magnétoencéphalographie (MEG). D&#39;abord, nous débattre d&#39;orientations générales et des questions qui doivent être considérés lors de l&#39;exécution des tests expérimentaux de la fonction cognitive chez les enfants. Deuxièmement, nous décrivons un protocole développé pour aligner les exigences du MEG collecte de données avec les capacités de motivation et de comportement de quatre ans, les enfants. 1. Considérations générales pour l&#39;étude des jeunes enfants avec le MEG MEG chercheurs font face à un certain nombre de défis uniques lorsqu&#39;ils travaillent avec des enfants sains éveillés. Tout d&#39;abord, un environnement de laboratoire austère et fonctionnelle est susceptible d&#39;intimider ou effrayer les jeunes enfants. Deuxièmement, les exigences de base d&#39;une étude expérimentale MEG incluent la restriction de mouvement et d&#39;assister activement à une tâche pendant une période prolongée, les conditions que de nombreux adultes à trouver pénible et inconfortable. Lorsque l&#39;on étudie les enfants, il devient impératif d&#39;adapter les procédures expérimentales pour les capacités et les limites des enfants. Dans cette section, nous décrivons les étapes initiales impliquées dans la préparation du sujet à participer à une séance d&#39;acquisition de données. 1.1 Familiarisation / session de formation: Pour enfants d&#39;âge préscolaire d&#39;une séance de familiarisation / formation est prévue avant la séance d&#39;acquisition de données réelles. Cette session permet à l&#39;enfant de se familiariser avec l&#39;environnement et les chercheurs à leur propre rythme. Nous introduisons l&#39;enfant et le parent pour les chercheurs et les familiariser avec l&#39;environnement de laboratoire et des routines. À la fin de la séance d&#39;introduction le parent et l&#39;enfant de comprendre toutes les étapes de participer et de comprendre ce qu&#39;ils doivent s&#39;attendre lors de l&#39;enregistrement des données. Si au cours de la première visite, un enfant apparaît timide ou anxieux, nous avons une période de temps de jeu jusqu&#39;à ce qu&#39;ils se sentent plus à l&#39;aise. Ensuite, nous procédons à la mise en place de toutes les étapes. 1.2 Explication de l&#39;environnement: Pour expliquer l&#39;environnement MEG à l&#39;enfant, nous employons un thème qui fournit une justification adaptés aux enfants pour l&#39;environnement. Par exemple, le système MEG est un vaisseau spatial d&#39;attente pour prendre les enfants sur une aventure spatiale où certains évènements inconnus peuvent se produire. Le laboratoire a également été décoré avec des stickers muraux et des jouets (Fig. 1), et il a une salle de jeu dédié. Lorsque vous parlez à l&#39;enfant, nous utilisons le langage que les enfants peuvent facilement comprendre comme le «gel», au lieu de «mouvement minimiser», et «casque de l&#39;astronaute&quot; au lieu de «marqueur bobine plafond». 1.3 Expliquer les procédures pour l&#39;enfant et aux parents: Nous montrer à l&#39;enfant et le parent les mesures qui sont prises avant que l&#39;enfant va à l&#39;intérieur de la salle à blindage magnétique (MSR). Une des premières étapes consiste à installer un marqueur de cinq-bobine capuchon sur la tête du sujet; ces bobines indiquer la position de la tête du sujet à l&#39;intérieur du casque de MEG. Avec l&#39;aide de l&#39;enfant, nous numérisons la forme la tête d&#39;une marionnette, et nous invitons l&#39;enfant et le parent pour accompagner la marionnette de la MSR / vaisseau spatial. Une fois à l&#39;intérieur du MSR, nous plaçons la tête de la marionnette à l&#39;intérieur du casque pour regarder un film. Nous avons ensuite demander à l&#39;enfant si elles veulent regarder le film avec les marionnettes. Si l&#39;enfant est à l&#39;aise et détendu et leurs parents est satisfait de nos protocoles, nous les invitons à jouer à un jeu à l&#39;intérieur du vaisseau spatial lors de leur prochaine visite de notre laboratoire. 1,4 classeurs: Nous avons classeurs basés sur le thème aventure spatiale qui montre les étapes les enfants auront lors de la session de test. Les enfants reçoivent ces worksbooks à la maison et travailler à travers eux avec leurs parents dans la préparation de la prochaine visite. L&#39;objectif des classeurs est de souligner l&#39;importance des trois principales exigences pour les tests suivants: a) l&#39;évitement de tout matériau ferreux à l&#39;intérieur du MSR, b) le placement de la bobine bouchon marqueur pour s&#39;assurer que les données précises de co-enregistrement, et c) et le importance de rester immobile pendant la numérisation et d&#39;acquisition de données. 2. Un protocole pour la mesure des signaux MEG du pré-scolaire des enfants âgés 2.1 Le matériel utilisé lors de l&#39;acquisition des données et la tâche expérimentale Marqueur bobine bouchon: en vue d&#39;aligner les données MEG avec des informations structurelles du sujet (par exemple, forme de la tête par IRM ou numérisés), un ensemble de cinq bobines sont placées dans un bonnet de bain que l&#39;enfant porte à l&#39;intérieur du casque de MEG. Ces bobines agissent comme points de référence et leurs positions sont comparées avant et après la tâche de mesurer à quel point la tête du sujet s&#39;est déplacé lors de l&#39;acquisition. Digitizer: Avant l&#39;acquisition de données, la position des cinq bobines marqueur et le forme de la tête du sujet est numérisé en utilisant un F Polhemusastrak ® numériseur (Colchester, VT). Le numériseur est constitué d&#39;un numériseur stylo, trois récepteurs, un émetteur et d&#39;une unité de suivi de mouvement. Ce processus de mesures de l&#39;emplacement des bobines. Plus tard, ces lieux sont comparées à des informations de localisation obtenues par le MEG pour aligner les données acquises magnétique et forme de la tête. Enfant MEG système: L&#39;acquisition des données se fait en utilisant toute une tête-enfant MEG système (KIT, Kanazawa, Japon) [2]. Les données sont acquises en continu à une fréquence d&#39;échantillonnage de 1000Hz, avec une bande passante de filtre en ligne entre 0,03 Hz et 200Hz. Positions serpentin marqueurs sont obtenues avant et après les enregistrements de mesurer les mouvements de tête. Les données sont rejetées si les mouvements de tête est supérieure à 5mm. MEG périphériques du système: les stimuli expérimentaux sont contrôlés avec un PC en utilisant Présentation ® (Systèmes neurocomportementales, Albany, Californie). Entrées visuelles sont livrés par un projecteur qui se trouve en dehors de la MSR et se reflète sur l&#39;écran de MSR. Les stimuli auditifs sont livrées par la recherche de modèle Etymotic ER-30 écouteurs insert équipé d&#39;écouteurs baby-taille en mousse (Etymotic Research Inc, Elk Grove Village, IL). L&#39;enfant est constamment surveillée par caméra en circuit fermé et l&#39;expérimentateur communique avec l&#39;enfant grâce à un microphone. 2.2 Acquisition de données: des sessions d&#39;enregistrement de données impliquent les étapes suivantes: Étape I: Avant l&#39;arrivée de l&#39;enfant Il est important d&#39;avoir tous les ordinateurs, les logiciels et le matériel prêt à commencer l&#39;expérience dès que l&#39;enfant arrive. Comme recommandation générale, deux chercheurs expérimentés devraient être présents alors que l&#39;enfant et le parent sont dans le laboratoire. Des communications claires entre le chercheur, parent et enfant sont cruciales pour le succès de l&#39;expérience. Phase II: Après l&#39;arrivée de l&#39;enfant <ol><li> Les formulaires de consentement sont signés et les expérimentateurs vérifier si les parents ont des questions. </li><li> L&#39;expérimentateur vérifie si l&#39;enfant se souvient de toutes les étapes introduit lors de la première réunion ou dans les brochures et réintroduit toutes celles qui ne sont pas mémorisées. L&#39;importance du point de congélation ou de minimiser le mouvement lors de l&#39;acquisition de numérisation et de données est soulignée. Cela peut être démontré à l&#39;aide d&#39;une marionnette. </li><li> Ensuite, l&#39;expérimentateur vérifie si l&#39;enfant est transportant les matières ferreuses (vêtements avec des taches paillettes, bijoux, jouets oubliés à l&#39;intérieur des poches, épingles à cheveux, etc.) Si elles portent un vêtement qui contient un matériau ferreux, nous leur fournissons des vêtements de sécurité MEG. Si le parent souhaite accompagner l&#39;enfant durant l&#39;expérience, nous nous assurons qu&#39;ils éliminent également les matériaux ferreux. </li></ol> Stade III: Mise à l&#39;enfant prêt à accomplir la tâche à l&#39;intérieur du MSR <ol><li> L&#39;expérimentateur s&#39;adapte le bouchon qui détient les 5 bobines marqueur. </li><li> L&#39;expérimentateur numérise l&#39;emplacement des bobines marqueur et forme de la tête de l&#39;enfant. Afin de maintenir la tête dans une position fixe, nous utilisons une minerve qui a été équipé de trois récepteurs. Il est important de renforcer l&#39;idée de minimiser le mouvement ou «gel» régulièrement pour obtenir une forme bonne tête. L&#39;enfant peut être récompensé avec un autocollant pour faire un bon travail au «gel». </li><li> L&#39;enfant est invité à entrer dans le MSR. Les écouteurs sont insérés et que l&#39;enfant est placé dans le casque MEG Dewar en position couchée. </li><li> Une fois que l&#39;enfant est couché confortablement avec leur tête dans le casque MEG, les bobines de marqueur sont connectés à leur unité d&#39;alimentation et la porte est fermée MSR. Un expérimentateur reste (et aussi un parent, si désiré) dans la salle pendant toute la session. </li><li> Pour le divertissement pendant l&#39;installation et entre les blocs de collecte de données, un film ou une bande dessinée peut être projetée sur le MSR rétroprojection écran. </li></ol> Stade IV: Exécution de l&#39;expérience <ol><li> Une fois la porte est fermée MSR, calmars sont engagés et d&#39;acquisition de données commence. </li><li> Comme l&#39;enfant regarde un film, un coregistration pré-test est effectué pour s&#39;assurer que les signaux MEG peuvent être recalées à la forme la tête numérisée. Ce pré-test consiste à apparier la position du marqueur de bobines obtenues au cours de numérisation avec la position affichée par le système MEG. </li><li> Une fois les spectacles premier test que la tête de l&#39;enfant est correctement positionné à l&#39;intérieur du casque, le chercheur peut commencer l&#39;expérience: (a) le film est coupé, (b) le chercheur demande aux enfants si ils sont prêts à «jouer le jeu»; (c) une fois que le jeu commence, l&#39;expérimentateur fournit régulièrement de l&#39;enfant avec rétroaction. Par exemple, un enfant peut être demandé à écouter une série de phrases, et à répéter un mot cible comme «fromage», dès qu&#39;ils l&#39;entendent. Ces mots cibles sont intégrés dans un sous-ensemble des prises trials que la sonde a poursuivi l&#39;attention à la tâche, mais ne sont pas inclus dans les analyses finales. </li><li> Une fois la tâche terminée, une autre mesure serpentin marqueur est effectuée pour surveiller position de la tête et le mouvement. </li><li> Une fois les calmars sont désengagés, la porte est ouverte et MSR l&#39;enfant est invité à une salle de jeux où ils peuvent choisir un prix pour leur bon travail. </li></ol> 3. Les résultats représentatifs Une étude représentative dans notre laboratoire a utilisé ce protocole pour l&#39;étude du développement de la logique dans le langage des enfants. Vingt-six enfants âgés de 3-4 ans (moyenne d&#39;âge de 4 ans et 5 mois) ont participé à au moins une séance d&#39;acquisition. Dix-sept de ces enfants sont retournés pour une séance de tests et de cinq secondes est venu pour une séance de tests tiers. Mouvement de la tête moyenne était inférieure à 3,7 mm (SD 3,1 mm), dans le seuil de 5 mm. Mouvements de plus de 5mm survenus chez 4,5% des séances, avec des variations allant de 5,5 mm à 15 mm (moyenne = 8,6 mm, sd = 2,5 mm). <img src="/files/ftp_upload/1693/1693fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Le casque MSR et MEG ont été décorés avec des autocollants et des peluches. <img src="/files/ftp_upload/1693/1693fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Quatre ans, fille de taille adulte MEG (à gauche). Notez le rembourrage au sommet de sa tête pour minimiser le mouvement et la distance entre la tête et le casque. Photo de droite montre la même fille dans le MEG enfant.

<ol>
	<li>H&#228;m&#228;l&#228;inen, M., Hari, R., Ilmoniemi, R. J., Knuutila, J., Lounasmaa, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetoencephalography-+theory,+instrumentation,+and+applications+to+noninvasive+studies+of+the+working+human+brain.">Magnetoencephalography- theory, instrumentation, and applications to noninvasive studies of the working human brain.</a> Rev. Mod. Physics. 65 (2), 413-497 (1993).</li><li>Johnson, B. W., Crain, S., Thornton, R., Tesan, G., Reid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+brain+function+in+pre-school+children+using+a+custom+sized+whole-head+MEG+sensor+array.">Measurement of brain function in pre-school children using a custom sized whole-head MEG sensor array.</a> Clin. Neurophysiol. , (2009).</li><li>Kado, H., Higuchi, M., Shimogawara, M., Haruta, Y., Adachi, Y., Kawai, J., Ogata, H., Uehara, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetoencephalogram+system+developed+at+KIT.">Magnetoencephalogram system developed at KIT.</a> IEEE Trans. Appl. Supercond. 9, 4057-4062 (1999).</li><li>Uehara, G., Adachi, Y., Kawai, J., Shimogawara, M., Higuchi, M., Haruta, Y., Ogata, H., Kado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Channel+SQUID+Systems+for+Biomagnetic+Measurement.">Multi-Channel SQUID Systems for Biomagnetic Measurement.</a> IEICE Trans. Electr. E86-C, 43-54 (2003).</li></ol>

Ce protocole est conçu pour faciliter les mesures de la fonction cognitive du cerveau en bonne santé et d&#39;éveil de 4 ans les enfants. Nous utilisons un système de taille personnalisée MEG conçu pour s&#39;adapter à la tête des enfants d&#39;âge préscolaire âgés. Avec ce système, un enfant-amicale environnement de laboratoire, et un protocole adapté aux capacités et aux motivations des enfants, nous sommes capables de mesurer le fonctionnement du cerveau cognitif dans une tranche d&#39;âge pour lequel il est actuellement très peu de données. Le système KIT-Macquarie est le premier système de mesure entière-tête de taille pour une utilisation avec enfants d&#39;âge préscolaire âgés. Il ya trois principaux avantages du casque personnalisé Dewar pour étudier les enfants. Tout d&#39;abord, le plus petit rayon de la configuration du capteur apporte les capteurs SQUID à portée des signaux neuromagnetic de têtes d&#39;enfants s. Deuxièmement, le plus petit casque permet l&#39;insertion complète de la tête d&#39;un enfant dans le Dewar. Insertion complète est empêché de casques Dewar adultes en raison de la petite couronne à l&#39;épaule à distance chez les enfants (voir Fig. 2). Ces deux facteurs sont fondamentaux dans l&#39;enregistrement de l&#39;activité cérébrale à l&#39;aide de signaux MEG parce neuromagnetic s&#39;atténuent rapidement avec la distance. Troisièmement, les aides personnalisées casque enfant dans le positionnement symétrique de la tête et les limites de la liberté de mouvement de la tête de l&#39;enfant au sein du Dewar. Ces fonctionnalités facilitent considérablement l&#39;installation, le positionnement et la mesure des signaux MEG des enfants. L&#39;avènement de taille personnalisée enfants MEG système est une avancée importante pour les neurosciences cognitives. Alternative techniques de neuroimagerie fonctionnelle qui emploient des produits radiopharmaceutiques ou des champs magnétiques puissants peuvent ne pas convenir pour une utilisation courante avec de jeunes enfants. Depuis MEG est une technique de mesure entièrement passive il n&#39;ya aucun risque concevable de développer des tissus. Il ya actuellement très peu de données MEG de sain enfants d&#39;âge préscolaire, parce que les adultes conventionnels systèmes MEG ne sont pas bien adaptés à utiliser avec les enfants. Enfant systèmes MEG va nous permettre d&#39;étudier le fonctionnement du cerveau aux âges où une structuration dramatique de l&#39;activité du cerveau se produit, fournissant de nouveaux aperçus sur le développement normal et pathologique des fonctions cognitives.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Whole head child MEG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kanazawa Institute of Technology (Kanazawa) and Yokogawa Electric Corporation (Tokyo)</td>
<td>Model PQ1064R-N2m</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnetically shielded room</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fujihara Co. Ltd., (Tokyo)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitiser</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polhemus (Colchester, VT)</td>
<td>Fastrack</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Experimental control software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Neurobehavioral Systems (Albany, CA)</td>
<td>Presentation</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Earphones</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Etymotic Research Inc. (Elk Grove Village, IL)</td>
<td>ER-30</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

measurement of neuromagnetic brain function in pre-school children with custom sized meg

Magnétoencéphalographie est une technique qui détecte les champs magnétiques associés à l&#39;activité corticale [1]. L&#39;activité électrophysiologique du cerveau génère des champs électriques - qui peuvent être enregistrés en utilisant l&#39;électroencéphalographie (EEG) - et leurs concomitante des champs magnétiques - détecté par le MEG. Signaux MEG sont détectés par des capteurs spécialisés connu comme dispositifs supraconducteurs à interférence quantique (SQUID). Capteurs supraconducteurs nécessitent un refroidissement à l&#39;hélium liquide à -270 ° C. Ils sont contenus à l&#39;intérieur d&#39;un casque vacumm isolé appelé un Dewar, qui est rempli de liquide. CALMARS sont placés dans des positions fixes à l&#39;intérieur du dewar casque dans le liquide de refroidissement hélium, et la tête d&#39;un sujet est placé à l&#39;intérieur du casque pour les mesures Dewar MEG. Le Dewar casque doit être dimensionné pour satisfaire les contraintes opposées. De toute évidence, il doit être assez grand pour s&#39;adapter à la plupart ou la totalité des têtes de la population qui sera étudiée. Cependant, le casque doit être également assez petit pour garder la plupart des capteurs SQUID à portée des champs minuscules cérébrale qu&#39;ils sont à mesurer. Conventionnel toute tête systèmes MEG sont conçus pour accueillir plus de 90% des chefs d&#39;adulte. Cependant les systèmes les adultes ne sont pas bien adaptés pour mesurer la fonction cérébrale chez les pré-scolaire chidren dont les têtes ont un cm de rayon de plusieurs plus petits que les adultes. Le KIT-Macquarie Brain Research Laboratory à l&#39;Université Macquarie utilise un système personnalisé de MEG dimensionné pour s&#39;adapter à la tête des enfants d&#39;âge préscolaire. Ce système enfant a 64 de premier ordre gradiomètres axiale avec une base de 50 mm [2] et est contenue à l&#39;intérieur d&#39;une salle de blindage magnétique (MSR), avec une taille adulte conventionnelle système MEG [3,4]. Il ya trois principaux avantages du casque personnalisé Dewar pour étudier les enfants. Tout d&#39;abord, le plus petit rayon de la configuration du capteur apporte les capteurs SQUID à portée des signaux neuromagnetic de têtes d&#39;enfants. Deuxièmement, le plus petit casque permet l&#39;insertion complète de la tête d&#39;un enfant dans le Dewar. Insertion complète est empêché de casques Dewar adultes en raison de la petite couronne à l&#39;épaule à distance chez les enfants. Ces deux facteurs sont fondamentaux dans l&#39;enregistrement de l&#39;activité cérébrale à l&#39;aide de signaux MEG parce neuromagnetic s&#39;atténuent rapidement avec la distance. Troisièmement, les aides personnalisées casque enfant dans le positionnement symétrique de la tête et les limites de la liberté de mouvement de la tête de l&#39;enfant au sein du Dewar. Lorsqu&#39;il est utilisé avec un protocole qui permet d&#39;aligner les exigences de collecte de données avec les capacités de motivation et de comportement des enfants, ces caractéristiques facilitent considérablement l&#39;installation, le positionnement et la mesure des signaux MEG.

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Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

L&#39;avènement de systèmes MEG taille pour les jeunes enfants ouvre de nouvelles possibilités importantes pour étudier le développement du cerveau. Le nouveau système, avec un protocole qui aligne les exigences expérimentales avec les capacités des enfants, peuvent être utilisées pour étudier les processus cognitifs et linguistiques dans la santé, les enfants éveillés trois à six ans.

Mesure de la fonction cérébrale Neuromagnetic En pré-scolaire des enfants à la coutume entreprises MEG

Magnetoencephalography is a technique that detects magnetic fields associated with cortical activity [1]. The electrophysiological activity of the brain ...

measurement-neuromagnetic-brain-function-pre-school-children-with

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K vues.  Macquarie University. L'avènement de systèmes MEG taille pour les jeunes enfants ouvre de nouvelles possibilités importantes pour étudier le développement du cerveau. Le nouveau système, avec un protocole qui aligne les exigences expérimentales avec les capacités des enfants, peuvent être utilisées pour étudier les processus cognitifs et linguistiques dans la santé, les enfants éveillés trois à six ans.

Vidéo: Measurement Of Neuromagnetic Brain Function In Pre-school Children With Custom Sized MEG

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

Cellules d&#39;imagerie à long terme des mammifères en utilisant la microscopie à champ large

Recherche

Biologie

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of imaging had invented. While many macroscopic parameters of blood flow reflect flow velocity, changes in blood flow velocity and red blood cell (RBC) flux does not hold linear relationship in the microscopic observations. There are reports of discrepancy between RBC velocity and RBC flux, RBC flux and plasma flow volume, and of spatial and temporal heterogeneity of flow regulation in the peripheral tissues in microscopic observations, a scientific basis for the requirement of more detailed studies in microcirculatory regulation using intravital microscopy. METHODS: We modified Jeff Lichtman's method of in vivo microscopic observation of mouse sternomastoid muscles. Mice are anesthetized,
ventilated, and injected with PKH26L-fluorescently labeled RBCs for microscopic observation.RESULT &amp; CONCLUSIONS: Fluorescently labeled RBCs are detected and distinguished well by a wide-field microscope. Muscle contraction evoked by electrical stimulation induced increase in RBC flux. Quantification of other parameters including RBC velocity and capillary density were feasible. Mice tolerated well the surgery, injection of stained RBCs, microscopic observation, and electrical stimulation. No muscle or blood vessel damage was observed, suggesting that our method is relatively less invasive and suited for long-term observations.

A new versatile method for observation of microcirculation is presented. It is considered suitable for long-term observation, and for combination with pharmacophysiological or molecular biological interventions.

In vivo la micro-circulation de mesure dans le muscle squelettique par voie intra-vitale microscopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as language1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, memory11, and attention12 is underway worldwide involving adults, children and infants 3,4,13,14,15,16,17,18,19 with typical and atypical cognition20,21,22. The contemporary challenge of using fNIRS for cognitive neuroscience is to achieve systematic analyses of data such that they are universally interpretable23,24,25,26, and thus may advance important scientific questions about the functional organization and neural systems underlying human higher cognition.
Existing neuroimaging technologies have either less robust temporal or spatial resolution. Event Related Potentials and Magneto Encephalography (ERP and MEG) have excellent temporal resolution, whereas Positron Emission Tomography and functional Magnetic Resonance Imaging (PET and fMRI) have better spatial resolution. Using non-ionizing wavelengths of light in the near-infrared range (700-1000 nm), where oxy-hemoglobin is preferentially absorbed by 680 nm and deoxy-hemoglobin is preferentially absorbed by 830 nm (e.g., indeed, the very wavelengths hardwired into the fNIRS Hitachi ETG-400 system illustrated here), fNIRS is well suited for studies of higher cognition because it has both good temporal resolution (~5s) without the use of radiation and good spatial resolution (~4 cm depth), and does not require participants to be in an enclosed structure27,28. Participants cortical activity can be assessed while comfortably seated in an ordinary chair (adults, children) or even seated in mom s lap (infants). Notably, NIRS is uniquely portable (the size of a desktop computer), virtually silent, and can tolerate a participants subtle movement. This is particularly outstanding for the neural study of human language, which necessarily has as one of its key components the movement of the mouth in speech production or the hands in sign language. 
The way in which the hemodynamic response is localized is by an array of laser emitters and detectors. Emitters emit a known intensity of non-ionizing light while detectors detect the amount reflected back from the cortical surface. The closer together the optodes, the greater the spatial resolution, whereas the further apart the optodes, the greater depth of penetration. For the fNIRS Hitachi ETG-4000 system optimal penetration / resolution the optode array is set to 2cm. 
Our goal is to demonstrate our method of acquiring and analyzing fNIRS data to help standardize the field and enable different fNIRS labs worldwide to have a common background.

Here we describe a data collection and data analysis method for functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS), a novel non-invasive brain imaging system used in cognitive neuroscience, particularly in studying child brain development. This method provides a universal standard of data acquisition and analysis vital to data interpretation and scientific discovery.

L&#39;exploration des fonctions cognitives chez les bébés, enfants et adultes avec la spectroscopie proche infrarouge

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Génome édition avec des nucléases personnalisés CompoZr doigt de zinc (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Mesure de la chimiotaxie cellulaire avec ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

Mesure de la force lors de la contraction d&#39;évaluer la fonction musculaire en poisson zèbre

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Mesure de la fonction musculaire lisse dans les tissus isolés Bath-applications à la pharmacologie de recherche

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Reconstitution fonctionnelle et Activité du Chan mesures de type sauvage purifiée et Mutant protéine CFTR

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

Imagerie optique basée sur des photodiodes pour l’enregistrement de la dynamique des réseaux avec une résolution mononeurone chez les invertébrés non transgéniques

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...