Nous sommes reconnaissants à Matthieu Robert Weatherhead pour un excellent service technique et John Ralph, Université du Wisconsin pour de précieux conseils, discussions, et l&#39;échantillon de bois de peuplier. Ce travail a été financé par les sciences chimiques, sciences de la terre et les sciences biologiques, Bureau des sciences fondamentales de l&#39;énergie, Bureau de la science, US Department of Energy (prix non. DE-FG02-91ER20021) et par le US Department of Energy (DOE) des Grands Lacs Bioenergy Research Center (DOE BER Bureau de la science-DE-FC02 07ER64494).

1. Paroi cellulaire d&#39;isolation <ol><li> moudre environ 60-70mg d&#39;air ou de gel de matériel végétal séché à 5,5 mm en acier inoxydable boules dans un tube de 2 ml Sarstedt bouchon à vis en utilisant un retschmill (1 min, 25 Hz). Une alternative, l&#39;utilisation d&#39;un meulage à haut débit et la distribution de robots appelés iWall est décrite dans la Partie I 3. </li><li> retirer les billes d&#39;acier avant de poursuivre la procédure d&#39;isolement de la paroi cellulaire Le protocole détaillé de la préparation du matériau de paroi cellulaire est indiqué dans la Partie I 3. Pour être complet ici les étapes écrites du protocole. </li><li> ajoutez 1,5 ml d&#39;éthanol aqueux à 70%, et le vortex soigneusement </li><li> centrifuger à 10000 rpm pendant 10 min pour sédimenter le résidu insoluble dans l&#39;alcool </li><li> Aspirer ou décanter le surnageant </li><li> ajouter 1,5 ml de solution de chloroforme / méthanol (1:1 v / v) au résidu et secouer le tube soigneusement de remettre en suspension le culot </li><li> centrifuger à 10000 rpm pendant 10 min et aspirer ou décanter le surnageant </li><li> Resuspendre le culot dans 500 ul d&#39;acétone </li><li> évaporer le solvant avec un courant d&#39;air à 35 ° C à sec Si nécessaire échantillons séchés peuvent être stockés à température ambiante jusqu&#39;au traitement ultérieur. </li><li> Pour lancer la suppression de l&#39;amidon de l&#39;échantillon re-suspendre le culot dans 1,5 ml d&#39;une 5,0 à 0,1 M d&#39;acétate de sodium tampon de pH. </li><li> Boucher les tubes Sarstedt et de la chaleur pendant 20 min. à 80 ° C dans un bloc de chauffage. </li><li> refroidir la suspension sur la glace </li><li> ajouter les agents suivants au culot: 35 pl d&#39;azide de sodium 0,01% (NaN 3), 35 Amylase ul (50 μg/1mL H 2 O; à partir d&#39;espèces de Bacillus, SIGMA), 17 pullulanase ul (18,7 unités provenant du Bacillus acidopullulyticus; SIGMA) . Boucher le tube et le vortex soigneusement. </li><li> La suspension est incubée pendant la nuit à 37 ° C dans le shaker. Orienter les tubes horizontalement aides meilleur mélange. </li><li> suspension de la chaleur à 100 ° C pendant 10 min dans un bloc de chauffage à mettre fin à la digestion. </li><li> centrifugeuse (10 000 rpm, 10 min) et éliminer le surnageant contenant de l&#39;amidon solubilisé </li><li> laver le culot restant à trois reprises en ajoutant 1,5 ml d&#39;eau, vortex, centriguation, et la décantation des eaux de lavage. </li><li> Resuspendre le culot dans 500 ul d&#39;acétone </li><li> évaporer le solvant avec un courant d&#39;air à 35 ° C jusqu&#39;à sec. Il peut être nécessaire aussi de briser la matière dans le tube avec une spatule pour un meilleur séchage. La matière sèche présente paroi cellulaire isolée (lignocellulosiques). Si nécessaire échantillons séchés peuvent être stockés à température ambiante jusqu&#39;au traitement ultérieur. </li></ol> 2. Composition de la matrice de polysaccharides Cette méthode est essentiellement une modification de la méthode publiée par Albersheim 1. <ol><li> Pour déterminer la composition en monosaccharides du matériau du mur pèsent de 2 mg de matériau de paroi cellulaire dans des tubes de 2ml Starstedt à la main ou dans un mode utilisant la highthroughput iWall, un robot robotique de broyage et de pesage. </li><li> Ajouter 20 uL d&#39;une solution d&#39;inositol (5mg/ml) comme standard interne. Pour un échantillon de 2 mg paroi cellulaire, nous recommandons d&#39;ajouter 100 ug. </li><li> rincez parois du tube avec 250 ul d&#39;acétone pour recueillir le matériau du mur de cellules sur le fond du tube et évaporer l&#39;acétone très doux sous flux d&#39;air. </li><li> Pour l&#39;hydrolyse acide faible ajouter 250 ul d&#39;acide trifluoroacétique 2M (TFA) à chaque échantillon. Ajouter TFA avec soin pour s&#39;assurer qu&#39;aucun matériel est éclaboussé de monter sur les parois du tube. </li><li> Fermer hermétiquement et laisser incuber pendant 90 min à 121 ° C dans un bloc de chauffage. </li><li> refroidir les blocs de chauffage et d&#39;échantillons sur la glace. </li><li> centrifuger les tubes à 10000 rpm pendant 10 min. </li><li> transférer 100 ul du surnageant acides contenant le polysaccharide matrice dérivée monosaccharide à une flacons en verre bouchon à vis en veillant à ne pas déranger le matériel de granules. Le culot peut être utilisé pour le dosage de la cellulose cristalline ci-dessous (voir 3.) </li><li> l&#39;évaporation de l&#39;AGT dans le tube de verre sous un léger courant d&#39;air dans un dispositif d&#39;évaporation. </li><li> Ajouter 300 pl 2-propanol, vortex et s&#39;évapore à 25 ° C (répéter pour un total de trois fois) </li><li> La première étape de la procédure de dérivatisation acétate d&#39;alditol est de réaliser une réduction des monosaccharides à leur alditols correspondants. A cet effet, ajouter 200 ul d&#39;une solution de borohydrure de sodium pour chaque échantillon séché. Préparer une solution fraîche chaque fois en utilisant 10 mg de borohydrure de sodium par 1 ml d&#39;hydroxyde d&#39;ammonium 1M. </li><li> laissez flacon en verre à température ambiante pendant 1,5 heures </li><li> neutraliser la solution par addition de 150 ul d&#39;acide acétique glacial </li><li> vortex et s&#39;évapore à 25 ° C. </li><li> Ajouter 250 pi de vortex acide acétique / méthanol (1:9, v / v) et évaporer à 25 ˚ C </li><li> Ajouter 250 ul de méthanol, et évaporer sous flux d&#39;air (répéter pour un total de trois fois) </li><li> Pour l&#39;acétylation des alditols, ajouter 50 ul d&#39;anhydride acétique et 50 pi de pyridine, vortex et incuber pendant 20 min à 121 ° C dans un bloc de chauffage. </li><li> les échantillons au frais dans le bloc vers le bas avec de la glace tout en attente pour diminuer température à la température ambiante environ. </li><li> évaporer l&#39;réactifs sous un léger courant d&#39;air à température ambiante. Soyez prudent: les acétates d&#39;alditols sont très volatils. </li><li> Ajouter 200 pi de toluène et évaporer sous air (x3) </li><li> Dans les étapes finales des acétates d&#39;alditols sont extraites. D&#39;abord, ajouter 500 ul d&#39;acétate d&#39;éthyle et agiter légèrement. </li><li> ajouter 2 ml d&#39;eau, des tubes à bouchon et le vortex. </li><li> Centrifuger les tubes à 2000 rpm pendant 5 min pour obtenir claires couches distinctes (acétate d&#39;éthyle sur le dessus, de l&#39;eau sur le fond) </li><li> pipette 50 ul de la couche d&#39;acétate d&#39;éthyle en GC / MS flacons avec des inserts. </li><li> diluer en ajoutant 100 ul d&#39;acétone pour le GC-flacon et le bouchon. Le volume d&#39;échantillon et les volumes de dilution peut être ajusté pour éviter de surcharger le GC / MS si la concentration de l&#39;échantillon est trop élevé. Le GC-flacon peut être conservé à 4 ° C, si l&#39;analyse par GC / MS n&#39;a pas de procéder immédiatement </li><li> Les échantillons sont injectés dans un GC qui est équipé d&#39;un MS quadripolaire, mais un détecteur à ionisation de flamme est également approprié. Une Supelco SP-2380 (30mm x 0.25mm x 0,25 um d&#39;épaisseur du film) colonne est utilisée avec un retard 4min solvant et un débit de 1.5ml/min. Échantillons injectés sont soumis au programme de température suivant: maintenir initiale à 160 ° C pendant 2 min, un 20 ° C / min rampe à 200 ° C et maintenir pendant 5 min, une rampe de 20 ° C min / à 245 ° C et maintenir 12 min; pic à 270 ° C et maintenir pendant 5 min avant de refroidir à la température initiale de 160 ° C 2,26) Peaks sont identifiées par les profils de masse et / ou temps de rétention des normes.. Les monosaccharides sont quantifiés en fonction des courbes standard. </li></ol> 3. Teneur en cellulose cristalline Cette méthode est essentiellement décrite par Updegraf 8. Il ya un certain nombre de matériaux de départ pour cette procédure: Isolé matériau de paroi cellulaire (voir 1) ou matériau du mur qui a déjà été traité avec 2M TFA (voir 2.8) soit le culot restant immédiatement après le traitement à l&#39;acide (voir 2.8) ou un TFA granulés, qui a été lavé avec 2-propanol et séché. <ol><li> Ajouter à la pastille TFA dans la vis en verre tube bouché 1 ml de réactif Updegraff (Acide acétique: acide nitrique: l&#39;eau, 8:01:02 v / v). </li><li> Tube de Cap serré, vortex, et la chaleur dans un bloc chauffant à 100 ° C pendant 30 min. En conséquence de ce traitement que la cellulose cristalline reste insoluble dans le culot. </li><li> Refroidir les échantillons dans le bloc sur la glace à la température ambiante ou froide </li><li> Centrifuger les échantillons à 10000 rpm pendant 15 min </li><li> Rejeter le surnageant veillant à ce que le culot n&#39;est pas perturbé et aucun matériau de la pastille est enlevée. A cet effet, laisser environ. 150 ul de surnageant dans le tube. </li><li> ajoutez 1,5 ml d&#39;eau, agitez, centrifugeuse, et éliminer le surnageant comme ci-dessus </li><li> répétez la procédure de lavage 3 fois supplémentaires en utilisant 1,5 ml d&#39;acétone </li><li> Air culot sec très doucement avec de l&#39;air, ou laisser sécher sur le banc durant la nuit </li><li> le culot (cellulose cristalline) est maintenant complètement hydrolysé en glucose par ce qu&#39;on appelle une hydrolyse Saeman. A cet effet, ajouter 175 ul d&#39;acide sulfurique 72% dans le tube Sarstedt </li><li> incuber à température ambiante pendant 30 min, vortex et incuber pendant 15 min </li><li> Ajouter 825 ul d&#39;eau et des tourbillons </li><li> centrifuger les échantillons à 10000 rpm pendant 5 min. Il pourrait y avoir matière brune insolubles, la lignine, restant dans le tube. </li><li> La teneur en glucose du surnageant est dosé en utilisant le dosage colorimétrique anthrone. Ce dosage est effectué dans une plaque de polystyrène 96 puits de microtitration. </li><li> Pour la courbe standard utilisent un stock de glucose 1mg/ml (stocké à 0 ° C) et de créer dupliquer 0, 2, 4, 6, 8 et 10 ug par pipetage normes 0, 2, 4, 6, 8, et 10 ul dans le puits approprié séparé. Remplir chaque ul ainsi jusqu&#39;à 100 à l&#39;eau. </li><li> Ajouter 10 ul de chaque échantillon et surnageant 90 ml d&#39;eau dans des cellules séparées mais sur la plaque de microtitration même que la norme. </li><li> Ajouter 200 ul de réactif Anthrone fraîchement préparé (Anthrone dissous dans l&#39;acide sulfurique concentré, 2 mg anthrone / ml d&#39;acide sulfurique) </li><li> de chaleur à plaques pendant 30 min à 80 ° C dans un four (dissipateur thermique en aluminium). Échantillons contenant du glucose détourner de jaune en bleu-vert. </li><li> laissez la plaque refroidir à température ambiante et agiter vigoureusement. </li><li> Lire l&#39;absorption de la plaque à 625 mm en utilisant un lecteur de microplaque. </li><li> Le glucose (et donc la teneur en cellulose cristalline) est calculé en fonction de l&#39;absorbance par rapport à la courbe standard établie sur la même plaque. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs Un exemple d&#39;une analyse de mur est présenté dans la Figure 2. Dans ce cas, le peuplier tige (bois) a été analysée par les différentes procédures décrites dans la section du protocole. La matrice de POla composition lysaccharide est soulignée par un chromatogramme par exemple identifier le sucre présent dans les typiques parois des cellules végétales, le fucose, le rhamnose, le xylose, l&#39;arabinose, le galactose, le mannose et le glucose (et l&#39;inositol standard interne). La principale composante hémicellulosiques de peuplier est xylane comme en témoigne le contenu du xylose élevé. Toutefois, l&#39;abondance de ces sucres peuvent varier en fonction de la matière première used4. Le glucose dans cette analyse est dérivé de la xyloglucane hémicellulose et la cellulose amorphe. Grâce à l&#39;analyse des données peut être présenté comme mol% ou matériau du mur ug / mg (ou poids sec). Le contenu de la cellulose cristalline est auto-explicatif, on peut s&#39;attendre à des valeurs comprises entre 20-50% de la muraille du poids sec. Sur la base des résultats présentés ici et dans la composition I3 partie lignocellulosique en bois de peuplier est de 21% de lignine, hémicelluloses 30% et 41% de cellulose cristalline. Le reste serait en cendres. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1:. Parois cellulaires Aperçu de l&#39;analyse lignocellulosique (lignocellulosiques) sont isolées de matières végétales brutes séchées. Le matériau du mur est alors pondérée en aliquots et subdivisé pour les dosages différents. Composition de polysaccharide Matrix est établi après le traitement de la matière du mur avec un acide faible (2M TFA), dérivatisation les monosaccharides résultant solubilisé à leurs acétates d&#39;alditols, et l&#39;analyse par GC-MS. Le résidu du traitement acide faible est lavé avec le réactif Updegraff dits ne laissant que la cellulose crystlline insolubles derrière. La cellulose est solubilisée par l&#39;acide sulfurique et quantifiée par un dosage colorimétrique pour déterminer la teneur en glucose. En parallèle, le contenu et la composition de la lignine peut être déterminée comme décrit dans la Partie I 3. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2:. Copeaux de bois complète l&#39;analyse lignocellulosiques à partir du bois de peuplier (Populus tremoloides) ont été soumis au protocole décrit. En haut à gauche: la composition de polysaccharide matrice; Fuc fucose; Rha rhamnose; Ara arabinose; Xyl xylose; Homme mannose; Gal galactose, glucose Glc; inositol standard interne.

<ol>
	<li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography.">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+Biofuels.">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li><li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass),+Part+I:+Lignin.">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li><li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar:+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases.">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li><li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS.">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li></ol>

Les méthodes décrites permettent une évaluation quantitative rapide de la composition de la biomasse végétale lignocellulosique. La méthode permet la détermination de la composition des matériaux tels le sucre, y compris la composition des polysaccharides matrice de savoir les hémicelluloses, la teneur en cellulose cristalline. Le débit des différentes méthodes analytiques par personne varie. En utilisant les protocoles décrits ici, 20 échantillons peuvent être traités pour des compositions de polysaccharides de la matrice et 30 pour le contenu de la cellulose cristalline. En raison de la nature quantitative des récoltes de données optimale les matières premières, de la variété ou des génotypes peut être évaluée en fonction de leur aptitude à la production de biocarburants.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Trifluoroacetic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T6508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myo-Inositol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>I5125</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Borohydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>213462</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pyridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>J.T. Baker</td>
<td>3348-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acetic Anhydride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>320102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spectromax Plus 384</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Plus384</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GC-MS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Agilent</td>
<td>7890A GC/5975C MSD</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5.5mm Stainless Steel Balls</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salem Ball Company</td>
<td>(N/A)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well plate heat spreader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocision</td>
<td>Coolsink 96F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Retsch Mill</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>TissueLyser II</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating block</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>Dri-block DB-3D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sample concentrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Techne</td>
<td>FSC400D</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part ii: carbohydrates

La nécessité pour les énergies renouvelables, neutres en carbone, et durable des matières premières pour l&#39;industrie et la société est devenue l&#39;une des questions les plus pressantes pour le 21e siècle. Cela a ravivé l&#39;intérêt dans l&#39;utilisation des produits végétaux comme matières premières industrielles pour la production de carburants liquides pour les transports<sup&gt; 2</sup&gt; Et d&#39;autres produits comme les matériaux biocomposites<sup&gt; 6</sup&gt;. La biomasse végétale reste une des plus grandes réserves inexploitées sur la planète<sup&gt; 4</sup&gt;. Il est principalement composé de parois cellulaires qui sont composées de polymères riches en énergie dont la cellulose, les hémicelluloses diverses, et la lignine polyphénol<sup&gt; 5</sup&gt; Et donc parfois appelés lignocellulosiques. Toutefois, les parois des cellules végétales ont évolué pour être récalcitrants à la dégradation des murs contribuent largement à la force et l&#39;intégrité structurelle de la plante entière. Malgré sa rigidité nécessaire, la paroi cellulaire est une entité très dynamique qui est métaboliquement active et joue un rôle crucial dans les activités de la cellule nombreux éléments tels que la croissance des plantes et de la différenciation<sup&gt; 5</sup&gt;. Grâce aux différentes fonctions des murs, il ya une immense diversité structurale dans les murs de différentes espèces végétales et de types de cellules au sein d&#39;une seule plante<sup&gt; 4</sup&gt;. Ainsi, selon ce que les espèces cultivées, la variété des cultures, ou les tissus végétaux est utilisé pour une bioraffinerie, les étapes de traitement de dépolymérisation par des procédés chimiques / enzymatiques et la fermentation subséquente des sucres divers biocarburants liquides doivent être ajustés et optimisés. Ce fait de la nécessité d&#39;une caractérisation complète des matières premières de biomasse végétale sous-tend. Nous décrivons ici une méthodologie globale d&#39;analyse qui permet la détermination de la composition de lignocellulosiques et se prête à une moyenne d&#39;analyse à haut débit (figure 1). La méthode commence avec la préparation des destarched matériau de paroi cellulaire. Le lignocellulosiques qui en résultent sont ensuite divisés pour déterminer sa composition monosaccharide des hémicelluloses et de la matrice d&#39;autres polysaccharides1, et sa teneur en cellulose cristalline<sup&gt; 7</sup&gt;. Le protocole pour l&#39;analyse des composantes de lignine dans la biomasse lignocellulosique est discuté dans la Partie I<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

La biomasse végétale est une grande neutralité carbone ressource renouvelable qui pourraient être utilisés pour la production de biocarburants. La biomasse végétale est principalement constitué de parois cellulaires, un matériau composite de structure complexe appelée lignocellulosiques. Nous décrivons ici un protocole pour une analyse complète du contenu et la composition des glucides mur dérivés.

Analyse de la composition globale de la paroi cellulaire végétale (biomasse lignocellulosique) Partie II: Glucides

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

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Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 3

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Isolement îlots pancréatiques humaines: Partie II: Purification et culture d&#39;îlots humains

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Tri cellulaire activé par fluorescence des protoplastes végétaux

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

Partie analyse complète de la composition des parois des cellules végétales (biomasse lignocellulosique) I: La lignine

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

Sans étiquette In situ</emImagerie> de lignification dans les parois des cellules végétales

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Profilage Glycan des polymères végétaux de la paroi cellulaire en utilisant Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Marquage métabolique et la membrane de fractionnement pour comparative Analyse protéomique de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cultures Suspension cellulaires

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l&#39;ensemble du montage ovules dans<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...