Pour commencer, lavez les CSPi cultivées avec le PBS ou le DPBS de Dulbecco. Et ajoutez un millilitre de mélange protéolytique et collagénolytique. Incuber le plat à 37 degrés Celsius pendant deux minutes pour détacher les cellules.
Ensuite, ajoutez 1,5 millilitre de milieu de culture iPSC préchauffé pour arrêter la réaction. Dissocier les cellules de la boîte de culture cellulaire en pipetant de haut en bas sept à 10 fois pour obtenir une suspension unicellulaire. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique de 15 millilitres.
Enduire les cellules à 200xg pendant cinq minutes à température ambiante. Et aspirer le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans deux millilitres de milieu de culture iPSC complété par 50 micromolaires Y27632.
Maintenant, utilisez 10 microlitres de la suspension cellulaire pour compter les cellules à l’aide d’une chambre Neubauer. Ajuster la concentration de la suspension cellulaire à 9 000 cellules par 150 microlitres en utilisant le milieu de culture iPSC complété par 50 micromolaires Y27632. Pour générer des corps embryoïdes ou EB, agiter le tube de suspension cellulaire pour empêcher la sédimentation cellulaire avant d’ensemencer 150 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 96 puits à très faible attache.
Culture des EB dans une atmosphère humifiée pendant 48 heures. À la fin de l’incubation, retirez 100 microlitres de milieu par puits. Et ajoutez 150 microlitres de milieu frais préchauffé sans Y27632.
Créez une grille de fossettes de quatre par quatre sur le parafilm en plaçant la grille de parafilm sur le support de tube de 0,2 millilitre avec le côté enveloppé de papier vers le haut. Et appuyez doucement un doigt ganté contre chaque trou de rack pour intégrer les EB dans la matrice de membrane basale. Ensuite, retirez le papier et découpez la grille de fossettes du carré de parafilm à l’aide de ciseaux pour ajuster sa taille afin de l’adapter à une boîte de culture cellulaire de 60 millilitres.
Replacez le parafilm alvéolé sur le support de tube de 0,2 millilitre pour fournir une base à la génération de gouttelettes de matrice membranaire basale. Transférez soigneusement les EB l’un après l’autre du puits de la boîte de culture aux fossettes de parafilm à l’aide d’une pipette avec une pointe de pipette coupée de 200 microlitres. Après avoir déplacé 16 EB vers le réseau, prenez une nouvelle pointe de pipette de 200 microlitres et retirez le milieu restant des fossettes.
Maintenant, pipeter une goutte de matrice membranaire basale sur chaque fossette contenant un EB. Prenez une pointe de pipette de 10 microlitres et déplacez rapidement les EB au centre de chaque gouttelette sans perturber les bords des gouttelettes. Placez le parafilm alvéolé avec les gouttes de matrice membranaire basale dans une boîte de culture cellulaire de 60 millimètres. Et incuber pendant 15 à 30 minutes à 37 degrés Celsius pour permettre à la matrice de polymériser.
De plus, pour détacher les EB intégrés dans la matrice du parafilm, ajoutez cinq millilitres de milieu de différenciation sans vitamine A au plat. Et tournez le carré du parafilm à l’envers à l’aide d’une pince de sorte que le côté avec les EB soit face au fond de la boîte. Secouez délicatement le plat pour détacher les gouttes de matrice de membrane basale contenant les EB du parafilm.
Si certains d’entre eux sont encore attachés, prenez un bord du carré parafilm à l’aide d’une pince et roulez-le rapidement vers le centre du plat plusieurs fois. Ensuite, culture des organoïdes cérébraux sur un agitateur orbital à 55 rpm dans une atmosphère humidifiée avec 5% de dioxyde de carbone et 95% d’air à 37 degrés Celsius. Gardez les organoïdes dans DM sans vitamine A avec des changements moyens tous les deux jours.
Une image en fond clair d’un organoïde cérébral humain 32 jours après l’ensemencement avec des structures en forme de ventricule à la périphérie et une morphologie compacte et saine est montrée.
