Commencez par préparer une quantité suffisante de mélange d’électroporation pour le témoin et le gène d’intérêt. Connectez la chambre d’électrode de la boîte de Petri à l’électroporateur. Ensuite, à l’aide des pointes du microchargeur, remplissez les aiguilles de micro-injection avec 8 microlitres de chaque mélange d’électroporation.
Coupez les pointes des aiguilles avant utilisation pour obtenir un écoulement stable à l’aide de ciseaux fins. Assurez-vous de ne retirer qu’une petite partie de la pointe, car une pointe émoussée et large peut endommager gravement les organoïdes. Au microscope, choisissez cinq organoïdes cérébraux avec des bords lisses et des structures visibles en forme de ventricule.
Ensuite, déplacez-les dans une boîte de culture cellulaire de 35 millimètres contenant du DMEM / F-12 préchauffé à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 1000 microlitres. Maintenant, insérez soigneusement l’aiguille à travers la paroi d’une structure en forme de ventricule et infusez-la avec le mélange d’électroporation jusqu’à ce qu’elle soit visiblement remplie. N’appliquez pas de pression excessive sur les structures ventriculaires pour éviter l’éclatement.
Transférer un organoïde cérébral micro-injecté dans la chambre d’électrode de la boîte de Petri avec une petite quantité de DMEM/F-12. Disposer l’organoïde de manière à ce que les surfaces des structures ventriculométriques microinjectées soient orientées vers l’électrode reliée au pôle positif de l’électroporateur. Maintenant, électroporate les organoïdes cérébraux un par un en utilisant cinq impulsions de 80 volts pendant 50 millisecondes chacune avec un intervalle d’une seconde.
Si la microinjection et l’électroporation ont été effectuées dans des conditions non stériles, déplacer les organoïdes électroporés sous une hotte à flux laminaire vers une nouvelle boîte de culture cellulaire de 35 millimètres remplie de DMEM/F-12 préchauffé. Ensuite, culture des organoïdes électroporés en DM avec de la vitamine A sur un agitateur orbital à 55 RPM dans une atmosphère humifiée de 5% de dioxyde de carbone et 95% d’air à 37 degrés Celsius. Le lendemain, après l’électroporation, vérifiez la réussite de l’électroporation des organoïdes cérébraux au microscope à fluorescence inversée conventionnel.
Transférer les organoïdes électroporés dans un tube centrifuge conique de 15 millilitres à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 1000 microlitres et éliminer l’excès de milieu. Ajouter une quantité suffisante de 4% de paraformaldéhyde dans le DPBS et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, aspirer le paraformaldéhyde.
Ajoutez ensuite 5 millilitres de DPBS, secouez doucement et aspirez le DPBS. Conservez les organoïdes dans DPBS à 4 degrés Celsius jusqu’à une utilisation ultérieure. Deux jours après l’électroporation, les cellules GFP positives sont presque exclusivement localisées dans la zone ventriculaire et sont positives pour Pax6, ce qui indique que ces cellules sont des progéniteurs apical ou des progéniteurs basaux nouveau-nés.
Après 10 jours, les cellules GFP-positives sont localisées dans les régions basales. Ces cellules sont également positives pour Pax6 ou NeuN, ce qui indique des progéniteurs basaux ou des neurones, respectivement. La reconstruction 3D des organoïdes cérébraux électroporés pour obtenir une impression de la distribution 3D des cellules GFP-positives est montrée.
