Pour commencer l’imagerie des cellules HeLa transfectées, sélectionnez un temps d’exposition suffisamment long pour les canaux de fluorescence individuels en mode de visualisation en direct en fonction des histogrammes d’intensité générés par le logiciel d’imagerie. Définissez le nombre approprié de plans pour l’imagerie sur l’axe Z. Sélectionnez le nombre approprié de champs de vision à afficher par puits.
Pour commencer l’analyse quantitative des images acquises, effectuez une correction d’arrière-plan pour toutes les images de tous les canaux de fluorescence. En fonction de la taille des objets analysés, sélectionnez la taille de filtre appropriée. Ensuite, commencez la segmentation de l’image en créant un masque de l’objet principal basé sur le rapport de l’intensité du signal fluorescent à l’arrière-plan pour le canal correspondant aux noyaux cellulaires.
Créez des masques pour les sous-objets représentant BrdU et les taches d’ADN mitochondrial en utilisant les canaux de fluorescence appropriés pour les structures données. Définissez les paramètres et mesurez l’intensité des pixels individuels dans chaque masque pour tous les canaux de fluorescence. Pour obtenir les intensités de fluorescence totales pour le BrdU ou canal ADN mitochondrial, additionnez les intensités de tous les sous-objets assignés à un noyau cellulaire donné.
Pour obtenir l’intensité moyenne de fluorescence, divisez l’intensité totale de fluorescence par la somme de l’aire des sous-objets affectés à un noyau cellulaire donné. Les résultats de l’imagerie ont été vérifiés en mesurant les niveaux d’ADN mitochondrial et d’expression génique à l’aide de la PCR quantitative en temps réel. Le traitement par didésoxycytidine ou DDC a entraîné une très forte diminution des niveaux d’ADN mitochondrial.
Un effet plus faible a été observé dans le silençage de l’hélicase TFAM et TWINKLE, tandis que la transfection de cellules avec l’ADN polymérase gamma mitochondriale ou POLG siRNA a eu un effet modeste sur le nombre de copies d’ADN mitochondrial. La quantification de l’expression de l’hélicase TFAM et TWINKLE a confirmé une réduction efficace de leur expression d’ARNm à environ 15 à 20% des niveaux de contrôle. Dans POLG, l’expression de l’ARNm n’a été réduite qu’à 30%, ce qui explique l’effet modeste inattendu sur le nombre de copies d’ADN mitochondrial.
