Préparez une machine de congélation à haute pression ou HPF, au moins deux heures avant de commencer l’expérience selon les instructions du fabricant. Transférer les supports en aluminium HPF de type A dans un tube centrifuge de deux millimètres contenant un millilitre d’éthanol et les sonifier dans un nettoyeur à ultrasons pendant 10 minutes. Sécher les supports dans une boîte de Petri recouverte de papier filtre qualitatif.
Faire tremper les supports pré-nettoyés dans du 1-hexadécène. Utilisez une pince à épiler fine pour ramasser un disque de saphir pré-préparé dans le plat de culture cellulaire HeLa. Touchez la surface étiquetée avec du papier filtre qualitatif pour éliminer l’excès de milieu.
Montez le disque de saphir dans le porte-échantillon HPF et coiffez rapidement le disque avec un support en aluminium de 0,025 millimètre de profondeur contenant du 1-hexadécène. Aspirer l’excès de solution avec du papier filtre qualitatif. Chargez le porte-échantillon pour la congélation à haute pression.
Déchargez le support de disque saphir sous azote liquide dans une boîte cryogénique en mousse. Préparez deux millilitres de la fixation de substitution de la congélation ou de la solution FSF un dans un récipient rond en polypropylène de 20 millimètres dans une hotte et congelez-le à l’azote liquide. Utilisez une paire de pincettes pré-refroidies pour charger les disques de saphir et les assemblages de support dans le récipient avec la solution FSF congelée un sous azote liquide.
Transférez ce récipient dans une chambre de congélation automatisée pré-refroidie pour le traitement FSF à moins 90 degrés Celsius. Conservez les échantillons à moins 90 degrés Celsius pendant une heure, puis séparez les disques de saphir des supports avec une pince à épiler pré-refroidie, en vous assurant que les côtés marqués des disques de saphir sont orientés vers le bas. Conservez les spécimens à moins 90 degrés Celsius pendant 8 à 10 heures supplémentaires avant de les réchauffer à moins 60 degrés Celsius dans les trois heures.
Remplacez la solution FSF un dans le récipient par de l’acétone prérefroidie et incuber à moins 60 degrés Celsius pendant une heure. Répétez ce lavage à l’acétone deux fois. Réchauffez-vous à moins 30 degrés Celsius en trois heures.
Pendant ce temps, préparez et pré-refroidissez deux millilitres de la solution FSF deux dans un tube centrifuge de deux millilitres à moins 30 degrés Celsius. Remplacer l’acétone par la solution FSF deux et incuber à moins 30 degrés Celsius pendant trois heures. Ensuite, remplacez la solution FSF deux dans le récipient avec de l’acétone pré-refroidie et incuber pendant 30 minutes à moins 30 degrés Celsius.
Répétez ce lavage à l’acétone deux fois. Chaud pour moins 30 à 4 degrés Celsius dans les deux heures. Remplacez l’acétone par deux millilitres de tampon HEPES 0,2 molaire.
Changez le tampon une fois et incuber à température ambiante ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
