Prenez un disque de saphir traité HPF et FSF pré-préparé contenant des cellules HeLa stables, lavez-le avec un tampon PBS-A pendant cinq minutes et répétez ce processus trois fois. Transférer les disques de saphir dans une boîte de culture de 35 millimètres contenant un millilitre de tampon PBS-A à température ambiante. Remplacez le tampon PBS-A dans la capsule de culture par un millilitre de solution réductrice et incuber pendant une heure à température ambiante.
Préparer le précurseur de l’or dans un millilitre de solution réductrice et mélanger immédiatement par vortex. Ajouter 80 microlitres de D-pénicillamine 500 millimolaires dans de l’eau distillée double à la solution de précurseur de l’or. Et immédiatement vortex.
Remplacez la solution dans le plat de culture par un millilitre de solution de précurseur d’or et incuber pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Ajouter 20 à 100 microlitres de la solution de borohydrure de sodium fraîchement préparée à la solution de précurseur de l’or, agiter immédiatement pour bien mélanger et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Remplacez la solution par deux millilitres de tampon PBS-A pour arrêter la réaction.
Ensuite, préparez le mélange de résine époxy selon les instructions du fabricant, transférez les disques de saphir dans des capsules d’enrobage à fond plat et infiltrez avec de la résine pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Polymériser l’échantillon à 60 degrés Celsius dans un four pendant au moins 18 heures. Préparer des sections ultra-minces de l’échantillon polymérisé en coupant soigneusement les blocs d’échantillon à l’aide d’un rasoir pour exposer les disques de saphir.
Trempez les extrémités des blocs avec des disques de saphir dans de l’azote liquide pendant plusieurs secondes et décongelez la température ambiante. Répétez l’action de gel-dégel plusieurs fois pour détacher les disques des blocs. La protéine EGFP-MTn-KDEL est apparue sous forme de nanoparticules d’or de deux à cinq nanomètres distribuées exclusivement dans la lumière périphérique ER et dans l’espace périnucléaire de l’enveloppe nucléaire.
L’ultrastructure bien préservée a permis l’identification d’une seule molécule des protéines marquées et a facilité l’analyse des interactions organites, telles que les interactions des mitochondries ER. Des nanoparticules de la protéine Ost4-EGFP-MTn ont délimité la membrane ER dans la membrane externe de l’enveloppe nucléaire. De même, les cellules exprimant Mito-acGFP-MTn présentaient un marquage spécifique dans la matrice mitochondriale.
