Pour commencer, prenez le transwell fixe avec des cultures RPE chargées de lipofuscine. Après avoir lavé les cultures avec PBS cinq fois, laissez une petite quantité de PBS dans la chambre apicale. Placez le transwell à l’envers sous un microscope à dissection.
À l’aide d’une lame de rasoir, couper la membrane semi-poreuse du transpuits en appliquant la force de coupe à la jonction de la membrane et du transpuits. Une fois la membrane transwell coupée, placez-la sur une lame de microscope à l’aide d’une pince. Essuyez l’excès de PBS avec un nettoyage de tâche tout en évitant de toucher les cellules.
Ajouter le support de montage suivi d’un bordereau de couvercle. Assurez-vous de garder une trace de quel côté du transwell est du côté droit. Ensuite, détectez l’antigène d’intérêt à l’aide d’un fluorophore, avec une excitation maximale d’environ 488 nanomètres et une détection d’émission de 500 à 530 nanomètres.
Configurez un canal séparé pour la détection par autofluorescence, avec une excitation de 405 nanomètres et une émission de 585 à 635 nanomètres. Les granules autofluorescents induits par OxOS ont montré plus d’accumulation après 20 tétées par rapport à cinq tétées. L’imagerie ratiométrique a permis de déchiffrer l’autofluorescence UAM de LC3 marqué avec Alexa 488.
Le canal rouge ne contient que du matériel d’autofluorescence non digestible et a aidé à séparer le signal LC3 du canal vert.
