Pour commencer, calculez le nombre de puits nécessaires à l’expérience. Ensuite, décongelez une quantité appropriée d’échantillon de système d’exploitation régulier. Ajoutez suffisamment de supports RPE pour atteindre une concentration finale du système d’exploitation de quatre fois 10 à la sixième par millilitre.
Retirer le milieu apical et ajouter 50 microlitres de quatre fois 10 au sixième OS par millilitre avec des concentrations appropriées de ligands pontants. Après l’ajout du système d’exploitation, incuber les échantillons pour différents points temporels. À la fin de l’incubation, ajouter 16,67 microlitres de tampon échantillon de Laemmli quatre fois avec des inhibiteurs de protéase pour lyser à la fois les cellules et le SG sus-jacent contenant le surnageant.
À l’aide d’une pipette P200, grattez la surface Transwell et recueillez le surnageant cellulaire et le lysat cellulaire combinés. Vortex et laisser à température ambiante pendant 30 minutes pour une dénaturation complète. Le transfert Western de la rhodopsine a montré que la bande de rhodopsine intacte était impossible à distinguer dans les cellules témoins et les cellules RPE chargées d’UAM.
Cependant, les produits de clivage de la rhodopsine étaient plus élevés dans le groupe UAM, suggérant un léger dysfonctionnement de dégradation dans le système phagolysosomal. Les niveaux égaux de GAPDH indiquent que le nombre de cellules entre les puits est égal. Différents anticorps de rhodopsine reconnaissent différents fragments de dégradation.
4D2 reconnaît l’extrémité terminale de la rhodopsine qui est intacte jusqu’aux dernières étapes de la dégradation lysosomale. En revanche, 1D4 reconnaît l’extrémité C de la rhodopsine qui est dégradée plus tôt dans le processus phagolysosomal.
