Activez tous les composants de configuration d’acquisition pour la mesure de fluorométrie. Placez le plat inférieur en verre de 35 millimètres contenant les fibres musculaires dissociées sur la scène du microscope. Retirez soigneusement le milieu de culture avec une pipette de 1 000 microlitres et remplacez-le par 2 millilitres de solution de sonnerie à température ambiante.
À l’aide d’un manipulateur mécanique ou motorisé, placez les deux fils de platine perpendiculairement au fond de la boîte. Assurez-vous que les bornes des électrodes sont alignées par rapport à l’axe longitudinal de la fibre et à quelques millimètres des extrémités de la fibre. Ajustez le positionnement de l’électrode en faisant pivoter le plat ou en déplaçant chaque électrode si elle est montée sur un micromanipulateur indépendant.
Allumez la lumière transmise et trouvez les fibres dans le champ de vision à l’aide d’un objectif 20 X. Déplacez le cube de filtre EGFP dans la voie de lumière. Après avoir éteint la lumière transmise, activez la lumière d’excitation de 488 nanomètres à l’aide d’un obturateur lumineux télécommandé.
Pour identifier les fibres EGFP positives, centrez les fibres avec le signal EGFP le plus lumineux au milieu du champ de vision. Utilisez un diaphragme positionné dans le trajet de la lumière d’excitation pour concentrer la lumière d’excitation dans une zone spécifique de la fibre. Cela permet l’acquisition du signal, où le signal EGFP CaV1.1 est maximal.
Ajustez la position de la fibre avec l’étage mécanique pour l’aligner sur le trajet lumineux du diaphragme et stockez l’emplacement XY de la fibre. Après être revenu à la première localisation enregistrée, réglez la durée de deux impulsions de stimulation séquentielles sur 1 milliseconde, l’amplitude sur 20 volts et la polarité des impulsions sur l’alternance. Ensuite, utilisez un interrupteur de déclenchement manuel pour délivrer les deux impulsions séquentielles.
Pendant la stimulation, observez deux contractions concentriques homogènes de fibres en réponse aux deux impulsions de polarité opposée. Si aucune contraction ou une seule contraction concentrique n’est observée avec des impulsions de polarité alternées, jetez les fibres du reste de l’expérience. Ajouter 2 microlitres de solution MTS 5 TAMRA de 10 millimolaires directement dans le plat et mélanger délicatement avec une pipette de 1 000 microlitres.
Incuber pendant quatre à cinq minutes pour permettre la diffusion de la molécule de thiol fluorescent dans la lumière du système tubulaire transversal. Grâce à la stimulation de champ, appliquer des stimulations répétitives bipolaires pour évoquer des trains potentiels d’action successifs à une vitesse de 50 hertz pendant 300 millisecondes toutes les 1 seconde pendant 5 minutes. Retirez la solution de coloration de la capsule à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres.
Et remplacez-le par 2 millilitres de solution de sonnerie à température ambiante. Laissez la fibre colorée récupérer du protocole de coloration pendant au moins 10 minutes. Après avoir réévalué la santé et l’activité électrique de la fibre avec deux impulsions alternées, déplacez le cube filtrant MTS 5 TAMRA dans la voie lumineuse et activez la lumière d’excitation de 533 nanomètres avec un obturateur de lumière télécommandé pour confirmer visuellement la coloration sur les fibres.
Ensuite, en utilisant l’emplacement stocké sur la platine motorisée, placez la fibre au milieu du champ avec le cube filtrant MTS 5 TAMRA, le diaphragme et l’objectif d’immersion dans l’huile 60X. Après avoir réorienté les fils de platine de stimulation de champ à chaque extrémité de la fibre, alignez les fils sur l’axe principal des fibres en ligne droite et espacez-les de cinq millimètres, avec la fibre au centre. Sur le logiciel d’acquisition, sélectionnez le protocole qui sera utilisé pour l’acquisition.
Cette étape est contrôlée uniquement avec l’ordinateur et déclenche tous les dispositifs en aval pour la stimulation électrique et le contrôle de l’obturateur du trajet de la lumière. Pour chaque protocole, minimisez autant que possible le temps total d’acquisition pour éviter le blanchiment du signal, mais prévoyez quelques dizaines de millisecondes d’éclairage lumineux et d’acquisition du signal avant la première stimulation électrique pour enregistrer une ligne de base. Exécutez le protocole en appuyant sur Exécuter.
Le signal enregistré est automatiquement affiché à l’écran. La faible amplitude du signal et la contraction mécanique rapide de la fibre cachent souvent la majeure partie du signal et affichent un artefact de mouvement. Ajouter 1 micromolaire de 100 millimolaires et de benzoyl para toluène sulfonamide à la solution d’enregistrement pour minimiser les réponses contractuelles et distinguer davantage le signal résultant des mouvements S4 dus à l’activation de la fibre.
Après quelques minutes, exécutez le même protocole une deuxième fois. L’artefact de mouvement est maintenant supprimé, mais un petit changement de fluorescence correspondant au mouvement S4 demeure. Déplacez légèrement la parabole à l’aide de la platine mécanique pour obtenir un signal provenant d’une zone sans fibres ni débris.
Exécutez le protocole une dernière fois pour enregistrer la fluorescence de fond. Exportez les traces et utilisez un tableur pour exprimer le signal en delta f sur f 0 en fonction du temps, et appliquez une correction de base si nécessaire. Les exemples d’images transmises et fluorescentes du muscle disséqué et non dissocié exprimant une construction EGFP CaV1.1 sont présentés ici.
Les images représentatives d’une fibre musculaire exprimant une construction EGFP CaV1.1 VS D3 avant et après coloration MTS 5 TAMRA sont montrées dans cette figure. Ce colorant colore également les cystéines endogènes de fibres non transfectées. Les images confocales d’une construction EGFP CaV1.1 VS D3 et d’une coloration MTS 5 TAMRA montrent un motif à double bande caractéristique de la localisation CaV1.1 sur le système tubulaire transversal de la fibre musculaire.
L’enregistrement fluorométrique représentatif en réponse à deux stimuli et mesuré avec une photodiode est montré ici. Les deux signaux sont normalisés par leur valeur minimale et tracés en fonction du temps par rapport à leur dépolarisation respective. Ces enregistrements montrent que la phase montante et le temps de crête du signal sont similaires pour les deux dépolarisations imposées à la fibre.
