Pour commencer la préparation de l’échantillon, disséquer la vraie feuille de l’échantillon transgénique d’Arabidopsis thaliana traité pharmacologiquement à l’aide d’une lame de rasoir tranchante. Placez la vraie feuille sur une lame de verre dans une goutte d’eau avec le côté abaxial vers le haut. Couvrez lentement la vraie feuille avec un bordereau de couverture sans bulles d’air.
Pour l’imagerie, configurez le trajet du faisceau en sélectionnant un laser de 514 nanomètres pour la protéine fluorescente jaune, ou excitation YFP. Obtenez une qualité d’image élevée en utilisant une puissance laser élevée. Activez PMT ou HYD et définissez les seuils de bande d’émission supérieur et inférieur en fonction du spectre du fluorophore YFP.
Définissez une fenêtre de détection de 530 à 570 nanomètres pour collecter le signal YFP. Pour l’image séquentielle de la deuxième couleur, cliquez sur le bouton Rechercher et ajoutez un nouveau canal. Dans la deuxième recherche, sélectionnez un laser de 555 nanomètres pour la protéine fluorescente rouge, ou excitation RFP, et définissez une fenêtre de détection de 570 à 630 nanomètres pour collecter le signal RFP.
Sélectionnez une lentille à noyau 63X, 1,2 W sur le système pour imager l’activité de trafic de la membrane subcellulaire dans les cellules précurseurs stomatiques. Commencez le format avec une taille d’image de 1024 par 1024 pixels, puis optimisez-le en fonction du facteur de zoom et des paramètres d’objectif pour une bonne résolution. Ensuite, configurez la vitesse de la tête de balayage, en commençant par une vitesse de 400 hertz, et optimisez-la en fonction de la situation spécifique des échantillons.
Pour zoomer sur une région d’intérêt sans changer l’objectif de l’objectif, entrez un facteur de zoom de un et optimisez-le en fonction des besoins spécifiques de l’expérience. La moyenne des lignes fait référence au nombre de fois que chaque ligne X sera numérisée pour obtenir un résultat moyen. Commencez avec une moyenne de lignes 2X pour l’imagerie des événements de trafic de membrane et optimisez au besoin.
sélectionnez le mode d’analyse XYT dans le mode acquisition pour activer l’utilitaire de séries chronologiques. Ensuite, sélectionnez la période d’attente entre les points de temps sous intervalle de temps. Définissez le nombre d’images à collecter en sélectionnant des images.
Utilisez le mode de balayage Z-stack avec la projection d’intensité maximale pour collecter les informations tridimensionnelles concernant l’événement de trafic de membrane dans la cellule entière. Sélectionnez ensuite le mode d’analyse XYZ en mode acquisition, puis l’utilitaire Z-stack deviendra accessible. Sélectionnez l’option Large Z.
En mode numérisation, définissez les images supérieure et inférieure de la pile Z à l’aide des boutons de début et de fin. Ensuite, définissez l’épaisseur de l’étape Z en cliquant sur la taille de l’étape Z. Pour traiter l’image, cliquez sur l’onglet processus principal dans le logiciel Confocal.
Sous l’onglet projets ouverts à l’extrême gauche, sélectionnez le fichier Z-stack intéressé. Ensuite, dans l’onglet central nommé Outils de processus, sélectionnez la fonction de projection. Choisissez maximum dans le panneau déroulant de la méthode et cliquez sur le bouton Appliquer.
Une image de projection Z-stack sera générée sous l’onglet projets ouverts. Pour générer la vidéo à partir des images de séries chronologiques, cliquez sur l’onglet Fichier dans le logiciel Fidji et ouvrez la fonction pour ouvrir toutes les images de séries chronologiques une par une dans le bon ordre. Vous pouvez également faire glisser les images sur l’image J pour ouvrir les données dans le bon ordre.
Ensuite, trouvez la fonction de pile dans l’onglet image et choisissez les images à empiler pour générer une vidéo. Une fois cela fait, enregistrez le fichier au format avi avec la fréquence d’images souhaitée. Dans la vraie feuille de plantes transgéniques âgées de sept jours portant le promoteur ERL1 ERL1 YFP, les cellules dispersées ont été mises en évidence par le signal YFP où ERL1 YFP a marqué la membrane plasmique.
Plusieurs signaux ponctués ont également été observés, suggérant que ERL1 était également localisé aux endosomes. RFP Ara7 a mis en évidence plusieurs signaux ponctués dans presque toutes les cellules, indiquant les corps multivésiculaires, ou MVB, dans ces cellules. Lorsque RFP Ara7 a fusionné avec le signal ERL1 YFP, la plupart des ponctuations se sont chevauchées, ce qui suggère que certaines molécules ERL1 YFP ont été transportées vers les MVB.
Des séries chronologiques de vraies feuilles portant ERL1 YFP et la protéine marqueur MVB RFP Ara7 ont montré que les endosomes marqués YFP se déplaçaient avec RFP Ara7 dans les cellules de la lignée stomatique. Il a confirmé que ERL1 YFP était localisé dans les corps multivésiculaires.
