À l’intérieur d’une armoire de biosécurité, retirez le tissu adipeux murin à l’aide d’une pince stérile. Une fois l’excès de PBS retiré, transférer le tissu dans une autre boîte de Pétri et laver deux fois pendant cinq minutes chacune avec 10 millilitres de solution de PBS AA. Ajouter 20 millilitres de solution de collagénase préparée dans un bécher en cristal contenant un tissu fragmenté de la taille d’un centimètre carré et une barre magnétique.
Incuber le bécher scellé à 37 degrés Celsius avec agitation continue. Filtrer l’homogénat à travers une ouverture en acier inoxydable de 0,38 millimètre à 40 mailles sur une boîte de Pétri et recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Suspendre soigneusement la fraction vasculaire stromale dans 20 millilitres de DMEM supplémenté chaud et centrifuger la suspension.
Après avoir jeté le surnageant, laver doucement les cellules deux fois avec 40 millilitres de milieu DMEM non supplémenté. Suspendre le palais dans cinq millilitres de DMEM supplémenté. Transférer la suspension dans une bouteille T de 25 centimètres carrés et incuber.
Lavez les cellules trois fois avec cinq millilitres de PBS AA chaud et deux fois avec du DMEM non supplémenté. Pour éliminer les débris cellulaires et les cellules non murines, ajoutez cinq millilitres de DMEM frais et chaud et changez le milieu tous les trois à quatre jours. Une fois que les cellules atteignent 90 à 100% de confluence, ajoutez un millilitre de solution chaude de trypsine EDTA aux cellules lavées DMEM.
Incuber pendant cinq à sept minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter quatre millilitres de DMEM supplémenté à la monocouche cellulaire détachée et désagréger doucement la suspension. Suspendre les cellules dans cinq millilitres de DMEM supplémenté chaud.
Après avoir centrifugé et jeté le surnageant, mélanger délicatement la pastille dans un millilitre de DMEM supplémenté. Colorez les cellules avec du bleu de trypan et comptez-les dans une chambre de Neubauer. Cellules de semence dans des flacons T-75.
Pour assurer la formation des colonies et une forte prolifération, observez la morphologie des cellules colorées à l’hématoxyline et à l’éosine au microscope optique. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine révèle un cytoplasme étendu avec des prolongements allongés et des microfilaments intracellulaires abondants.
