Pour commencer, prenez une fiole de cellules de fibroblastes en culture, enduisez une plaque de culture cellulaire de 10 centimètres adaptée à la culture de CSPhi avec quatre millilitres de solution d’enrobage à froid par plaque et incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius. Ensuite, retirez le média des fibroblastes et lavez-les avec quatre millilitres de PBS préchauffé par flacon. Aspirer le PBS et associer les fibroblastes à quatre millilitres de trypsine-EDTA par fiole en incubant pendant cinq à sept minutes à 37 degrés Celsius.
Surveillez le détachement des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase et, si nécessaire, tapotez contre le côté du flacon pour détacher les cellules de la surface en plastique. Transférer les cellules détachées dans un tube conique de 50 millilitres et laver les flacons vides avec six millilitres de milieu fibroblastique préchauffé. Recueillir et mettre en commun les cellules restantes dans le tube conique.
Ensuite, centrifugez les cellules à 200 g pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans trois millilitres de PBS frais et préchauffé. Comptez les cellules, transférez 1,5 fois 10 aux sixièmes fibroblastes dans un nouveau tube conique et remplissez de PBS jusqu’à la marque de cinq millimètres.
Centrifuger le tube à 200 g pendant cinq minutes à 20 degrés Celsius. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille de cellule dans cinq millilitres de milieu d’électroporation et centrifuger à nouveau. En attendant, aspirez la solution d’enrobage de la plaque de culture cellulaire enduite de 10 centimètres et ajoutez sept millilitres de milieu fibroblastique préchauffé.
À la fin de la centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu d’électroporation avec une concentration de 1,5 fois 10 aux sixièmes cellules dans 250 microlitres. Transférer la suspension cellulaire de 250 microlitres dans une cuvette d’électroporation avec une distance d’intervalle de quatre millimètres. Ensuite, préparez un mélange de transfection plasma en ajoutant quatre microgrammes de chaque plasmide à un volume total de 50 microlitres de milieu d’électroporation.
Transférer le mélange de transfection dans la cuvette, mélanger doucement en agitant et électroporer avec une impulsion à 280 volts. Enfin, transférez 150 microlitres de fibroblastes électroporés dans la plaque de culture cellulaire préparée de 10 centimètres. Agiter la plaque trois fois dans toutes les directions pour répartir les cellules, et incuber pendant la nuit.
Les fibroblastes sont présents dans un long phénotype en forme de fuseau, de la taille de 150 à 300 nanomètres. Après reprogrammation, des colonies avec des hiPSC de 50 micromètres se produisent présentant des bordures distinctes. Les CSPhi se distinguent par un rapport noyaux/corps élevé et un taux de prolifération accru.
