Pour commencer, prenez la plaque de fibroblastes électroporés et observez la formation de colonies de CSPhi sous un microscope à contraste de phase objectif 10x à 20x. Les colonies hiPSC avec un diamètre de 300 micromètres, des bordures distinctes et un rapport noyaux / corps élevé conviennent à la cueillette. Avant de cueillir, enduisez les puits d’une plaque de 96 puits adaptée à la culture hiPSC avec 100 microlitres de solution de revêtement.
Et incuber pendant une heure à 37 degrés Celsius. Pendant l’incubation, marquez les colonies d’intérêt au fond de la boîte de culture cellulaire avec un stylo. Pour la préparation finale de la plaque de 96 puits, retirer la solution de revêtement et ajouter 100 microlitres de milieu de culture hiPSC préchauffé, contenant 10 micromoles d’inhibiteur de ROCK Y-27632 à chaque puits.
Ensuite, lavez les cellules avec du PBS préchauffé et ajoutez un milieu de culture d’hiPSC préchauffé contenant 10 micromoles d’inhibiteur de ROCK Y-27632 avant de les prélever pour éliminer les cellules mortes. Choisissez les colonies hiPSC à l’aide d’une aiguille de calibre et divisez-les en petits morceaux en dessinant une grille dans chaque colonie. Ensuite, utilisez un microscope à contraste de phase pour vérifier que les colonies sont divisées avec succès en morceaux.
Enfin, transférer les colonies avec une pipette de 100 microlitres dans la plaque préparée de 96 puits, en tenant la pipette verticale au-dessus de la colonie. Laissez les cellules se fixer pendant la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone sans perturbation. Le lendemain, remplacez le milieu par 200 microlitres de milieu de culture hiPSC frais pour retirer l’inhibiteur de ROCK Y-27632 et replacez les plaques dans l’incubateur.
Surveillez la plaque de 96 puits et marquez les puits avec des clones choisis avec succès. Les clones marqués peuvent être étendus et congelés à ce stade. Les images de contraste de phase ont reprogrammé avec succès des colonies de hiPSC, des hiPSC sélectionnées, des colonies spontanément différenciées, des colonies non-hiPSC et une culture hiPSC trop dense sont présentées.
