Le premier jour, après la réticulation de la chromatine et la collecte des noyaux de 5 000 vers Caenorhabditis Elegans jeunes adultes, transférez la pastille de noyaux remise en suspension dans 450 microlitres d’eau propre dans un tube microcentrifuge propre de 1,5 millilitre. Ensuite, ajoutez-y 60 microlitres de tampon enzymatique de restriction DPN2 10X et mélangez bien. Incuber les échantillons avec 15 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 10% à 37 degrés Celsius pendant une heure en agitant.
Éteignez la réaction en ajoutant 75 microlitres de 20% triton X 100 et en incubant comme démontré précédemment. Aliquote 10 microlitres de l’échantillon, comme témoin non digéré, et le stocker à quatre degrés Celsius. Après avoir ajouté 400 unités de DPN 2 au reste de l’échantillon, incuber pendant une nuit à 37 degrés Celsius avec agitation pour la digestion de la chromatine.
Le deuxième jour, ajoutez 200 unités supplémentaires de DPN 2 à l’échantillon. Pour terminer la digestion de l’échantillon réticulé, incuber à 37 degrés Celsius en agitant pendant quatre heures. La chaleur inactive l’enzyme de restriction en incubant l’échantillon pendant 20 minutes à 65 degrés Celsius.
Si l’enzyme ne peut pas être inactivée par la chaleur, ajoutez 80 microlitres de sulfate de dodécyl de sodium à 10% et incuber. Ensuite, ajoutez 375 microlitres de 20% Triton X 100 à l’échantillon et mélangez en tourbillonnant. Gardez de côté une partie aliquote de 10 microlitres de l’échantillon comme contrôle de la digestion.
Pour la ligature de la chromatine, transférer l’échantillon dans un tube conique propre de 50 millilitres. Ajuster le volume de l’échantillon à 5,7 millilitres avec de l’eau de qualité moléculaire et mélanger en tourbillonnant. Ensuite, ajoutez 700 microlitres de tampon 10 X T4 ligase, suivis de 60 unités d’ADN ligase T4, et incuber l’échantillon pendant la nuit à 16 degrés Celsius.
Le troisième jour, procédez à la digestion des protéines et à la réticulation inverse. Ajouter 30 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de protéinase K à l’échantillon 3C et incuber à 65 degrés Celsius pendant la nuit avec agitation. Pour commencer la purification de la bibliothèque 3C le quatrième jour, ajoutez 30 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de RNase A à l’échantillon et mélangez en tourbillonnant.
Après l’incubation, ajouter sept millilitres de phénylchloroforme aux échantillons et mélanger en agitant. Centrifuger l’échantillon pendant 15 minutes à 3, 270 G et à température ambiante. Recueillir et transférer la phase aqueuse dans un tube conique propre de 50 millilitres.
Ajouter des volumes égaux de chloroforme et mélanger l’échantillon en agitant. Après avoir centrifugé à nouveau l’échantillon comme démontré, transférer la phase aqueuse dans un autre tube conique propre de 50 millilitres. Ajouter 7,5 millilitres d’eau de qualité moléculaire, 35 millilitres d’éthanol à 100% et sept microlitres d’un milligramme par millilitre de glycogène.
Congeler l’échantillon correctement mélangé à moins 80 degrés Celsius. Pendant que l’échantillon gèle, commencez à purifier les échantillons témoins en ajustant le volume des témoins à 500 microlitres en utilisant de l’eau de qualité moléculaire. Ajouter deux microlitres de 10 milligrammes par millilitre de RNase A et mélanger en agitant le tube.
Ensuite, ajoutez un millilitre de phénylchloroforme aux tubes contenant les témoins et mélangez en agitant. Centrifuger les tubes. Après avoir transféré la phase aqueuse dans un tube microcentrifuge propre de 1,5 millilitre, ajouter des volumes égaux de chloroforme.
Centrifuger comme démontré précédemment avant de recueillir la phase aqueuse. À la phase aqueuse recueillie, ajoutez un millilitre d’éthanol et deux microlitres d’un milligramme par millilitre de glycogène. Après avoir mélangé l’échantillon en agitant, incuber à moins 80 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, centrifuger l’échantillon pendant 15 minutes à 3, 270 g à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, ajoutez 750 microlitres d’éthanol refroidi à 70% et centrifugez. Re-suspendre le granulé séché à l’air dans 50 microlitres d’eau de qualité moléculaire.
La suspension peut être gelée ici si elle ne va pas plus loin immédiatement. Pour poursuivre la purification de l’échantillon 3C, retirer l’échantillon du congélateur et centrifuger à 3, 270 g pendant 30 minutes. Ajouter 10 millilitres d’éthanol réfrigéré à 70% et briser la pastille d’ADN.
Après centrifugation et retrait du surnageant, sécher partiellement l’échantillon à l’air libre à température ambiante. Remettez en suspension la pastille dans 150 microlitres de 10 millimolaires tris HCL à pH 7,5 en pipetant de haut en bas pour obtenir la bibliothèque 3C purifiée. La QPCR réalisée sur un échantillon expérimental et deux échantillons témoins 3C a permis de générer les données sur l’efficacité de la digestion.
L’échantillon 3C avait une efficacité de digestion d’environ 88% sur les sept loci génomiques testés.
