Ce travail a été soutenu en partie par le Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence du National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health sous le numéro de subvention P20GM103430 et le Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Capture de la conformation chromosomique (3C) pour la recherche et l’enseignement de premier cycle

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R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My5C:+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies.">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li><li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression.">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).</li></ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Le 3C est une technique puissante qui est enracinée dans les techniques moléculaires de base. C’est cette base d’outils fondamentaux qui fait de 3C une technique si intrigante à utiliser avec les étudiants de premier cycle. Avec autant d’études récentes observant la dynamique de la chromatine à une si grande échelle, l’utilisation de ces résultats pour concevoir une expérience étroitement ciblée sur un seul gène ou une seule région génomique a le potentiel de créer une expérience unique et percutante dans la recherche de premier cycle. Souvent, de telles expériences sont considérées comme trop avancées pour les étudiants de premier cycle, mais avec une planification minutieuse, elles sont facilement réalisables. Il est important de noter que les tests conçus pour sonder les connexions chromatines capturées par la bibliothèque 3C peuvent varier de la PCR semi-quantitative au séquençage du génome entier. En fait, les données du premier article3C 16 ont été générées à partir de qPCR. Cette large gamme de tests peut tous être utilisés parce que toutes les technologies 3C produisent le même produit - une bibliothèque de fragments d’ADN représentant des connexions 3D dans le noyau.
Présenté ici est une adaptation d’un protocole plus flexible et accommodant qui convient mieux aux chercheurs de premier cycle. Les périodes de pause énumérées ci-dessus impliquent des retards de nuit; Cependant, ces pauses peuvent s’étendre sur les week-ends et, dans le cas des cellules et des noyaux, pendant des semaines. La considération la plus cruciale est le moment où le travail sera terminé. Souvent, dans les protocoles, il y a des étapes urgentes où la pause n’est pas une option. En dehors de quelques points (jour 1 et jour 2), il existe de nombreux endroits pour s’arrêter et congeler l’échantillon. Ceux-ci sont essentiels lorsque vous travaillez avec des étudiants de premier cycle où les horaires et les horaires des travaux de laboratoire doivent être flexibles. En plus d’intégrer ces arrêts dans le protocole, les étudiants de premier cycle sont encouragés à travailler en paires ou même en petits groupes de trois ou quatre. Les groupes fonctionnent bien pour ce protocole, car les étudiants peuvent se soutenir mutuellement et créer un système de jumelage pour que tout le monde travaille en toute sécurité. Le travail de laboratoire est également plus amusant avec les autres personnes impliquées. Avec les groupes, les étudiants peuvent également travailler sur une variété de questions axées sur l’organisation de la chromatine tout en exécutant le même protocole. Ainsi, même si les étudiants travaillent sur des projets distincts, le protocole relie leurs efforts et, de ce fait, ils peuvent se soutenir mutuellement.
D’autres adaptations visent à contourner le fait que certains outils et équipements spécialisés ne se trouvent pas nécessairement dans tous les établissements de premier cycle. Ces pièces d’équipement comprennent, sans toutefois s’y limiter, les thermocycleurs qPCR, les systèmes de documentation sur gel et les spectromètres de nanovolume. En effet, ces équipements sont pratiques mais ne sont pas une exigence. Ici, la méthode classique de 3C est également décrite dans la partie de conception de l’apprêt; Cela implique d’identifier un locus génomique d’intérêt et, à partir de là, d’évaluer d’autres loci génomiques pour les points de contact de la chromatine plus éloignés. Cette technique fonctionne également bien si un ensemble de données publié est utilisé, tel qu’un ensemble de données utilisant Hi-C, où des loci positifs connus (connectants) et négatifs (non connectés) sont identifiés. La conception d’expériences utilisant ces ensembles de données publiés est une autre excellente adaptation pour les laboratoires d’enseignement, car les chances d’identification réussie des connexions chromatiniques sont généralement plus grandes. De plus, l’article de recherche peut être discuté en classe et servir de référence.
Ce protocole utilise une approche qPCR modifiée pour visualiser la formation du produit 3C. Les contrôles sont essentiels au succès de la technique 3C. Chaque expérience utilise à la fois des contrôles d’échantillon et des contrôles d’amorce pour déterminer l’achèvement de la procédure 3C. Les contrôles de l’échantillon comprennent un contrôle non digéré (ADN génomique) et un contrôle digéré. Le contrôle non digéré détermine le signal de base pour les ensembles d’amorces et est utilisé avec le contrôle de digestion réticulé pour déterminer l’efficacité de la digestion. On s’attend à ce qu’il y ait une baisse de produit pour tous les apprêts dirigés à travers un site de restriction. La comparaison de cette valeur avec le témoin non digéré donne une indication de la façon dont l’échantillon a été digéré.
Les amorces pour la PCR comprennent une amorce de contrôle et des amorces de test. L’amorce de contrôle est un ensemble d’amorces qui se trouve près de la région génomique à tester et qui ne contient pas de site de restriction. Cela fournit la base de référence pour déterminer l’abondance des produits PCR d’amorce d’essai. Les amorces d’essai sont des amorces avant et arrière qui flanquent un site de restriction pour un locus génomique d’intérêt particulier (Figure 3). Les réactions utilisant ces jeux d’amorces sont comparées pour déterminer l’efficacité de la digestion, car l’abondance du produit devrait diminuer si le site de restriction a été coupé. Pour déterminer l’organisation de la chromatine, une amorce de test d’un locus est associée à une autre amorce de test d’un locus génomique différent pour déterminer si ces deux loci sont proches l’un de l’autre dans l’espace 3D. Dans ce cas, on s’attend à ce qu’un produit de PCR ne soit trouvé qu’en utilisant l’échantillon 3C comme modèle.
Il est important de noter que même les amorces validées ont tendance à échouer (Figure 4 : jeu d’amorces r14). En outre, les produits de PCR sont fréquemment identifiés dans les réactions de contrôle et dans les réactions dans lesquelles une connexion de chromatine n’est pas prévue (comme le témoin digéré, puisqu’il n’est pas ligaturé). Ces instances sont séquencées et échouent à Sanger QC ou reviennent sans séquence définie (Figure 5). De plus, les expériences 3C traditionnelles génèrent un « modèle de contrôle », un échantillon d’ADN non réticulé, digéré et ligaturé, qui représente tous les fragments ligaturés possibles pouvant être produits avec une quantité donnée d’ADN. Le « modèle de contrôle » joue un rôle important dans la comparaison des intensités des signaux qPCR entre deux loci génomiques afin de déterminer si le signal représente une véritable interaction ou simplement une association aléatoire. La création d’un « modèle de contrôle » peut être problématique, car une grande partie de la chromatine analysée doit être capturée sous la forme d’un chromosome artificiel et traitée avec les échantillons 3C. Sécuriser une telle construction peut ne pas être faisable, et en créer une pourrait sortir de la portée d’un projet semestriel. En raison de ces difficultés, nous suggérons d’utiliser un abécédaire de contrôle. L’introduction au contrôle ne remplace pas toutes les fonctionnalités du « modèle de contrôle », mais offre tout de même la possibilité d’analyser les données pour déterminer la « présence » ou l'« absence ».
Lors de la qPCR, il est important d’utiliser des quantités égales de l’échantillon. Cela devrait être déterminé, même en utilisant un nano-spectrophotomètre tel qu’une nanogoutte, en générant une courbe standard à partir d’ADN génomique d’une concentration connue et en ajustant les échantillons 3C à cette ligne. Ces montants doivent être enregistrés et utilisés dans les PCR ultérieures. La qualité de la réaction PCR est également importante. Comme la PCR s’exécute en qPCR, l’abondance du produit est mesurée par fluorescence et enregistrée. Cet enregistrement est accessible dans le tracé d’amplification. Une fois le programme terminé, il est important de vérifier le graphique d’amplification et de s’assurer que les réactions (à l’exception des contrôles sans modèle) ont trois phases: une ligne de base, une exponentielle et une phase de plateau/saturation. Il est important de vérifier que les réactions ont une phase exponentielle, en particulier pour fixer le seuil (voir ci-dessous). De plus, pour les échantillons dilués en série, il devrait y avoir un changement dans les valeurs Ct correspondant à la dilution de l’échantillon (la concentration la plus élevée aura les valeurs Ct les plus faibles, tandis que la concentration la plus faible aura les valeurs Ct les plus élevées). Les échantillons qui ne reflètent pas ce changement dans la place d’amplification nécessitent une nouvelle dilution ou indiquent un problème plus important avec la formation de l’échantillon 3C. Enfin, tout en générant la courbe standard, le logiciel de PCR calculera l’efficacité de la PCR et la valeurR2 . L’efficacité de la PCR doit être supérieure à 90 % et la valeur de R2 doit être supérieure à 0,99. Si l’une ou l’autre de ces conditions n’est pas remplie, il est probable que quelque chose ne va pas avec l’échantillon ou les amorces PCR.
Après qPCR, le pourcentage de digestion et la présence d’interactions 3C peuvent être calculés en utilisant la qPCR Ct pour chaque réaction. Pour les déterminer, il faut d’abord définir le seuil de la réaction PCR. Cela se fait normalement à l’aide du logiciel fourni avec la machine qPCR. L’établissement du seuil définira la concentration du produit PCR qui sera utilisé pour comparer les valeurs Ct de l’échantillon. Le seuil doit couper en deux les courbes d’amplification des réactions de PCR dans la phase exponentielle d’amplification. Seules les réactions PCR avec amplification exponentielle peuvent être comparées (dans ce cas, les amorces de contrôle et les réactions d’amorce de test), car c’est le seul moyen de s’assurer que les réactions amplifient l’ADN au même rythme et peuvent être comparées fidèlement. Lors de l’analyse des graphiques 3C, les réactions conditionnellement positives sont identifiées comme celles avec plus de produit que les échantillons témoins, le contrôle génomique et le contrôle de la digestion (Figure 4B). Cependant, ces échantillons doivent être validés davantage à l’aide du séquençage de Sanger après la purification du gel du produit PCR.
Après le séquençage de Sanger, les échantillons qui passent le QC peuvent être analysés à l’aide de Blat. Le but de cette analyse est de déterminer si l’échantillon a la séquence des deux loci génomiques cibles flanquant le site de restriction (DpnII dans le cas de ce protocole). Si les deux séquences sont identifiées, le fragment 3C peut être considéré comme validé. Si les résultats du Blat ne renvoient pas la séquence attendue, cela peut indiquer que l’une ou les deux amorces ne sont pas optimales, ce qui entraîne un résultat qPCR faussement positif. Les fichiers de trace des échantillons faussement positifs auront des pics de base non définis et les rapports Seq contiendront principalement « n » appels de base.
La validation de Sanger est essentielle, car les faux positifs de la formation artificielle de produits PCR sont possibles. Ces faux positifs peuvent être identifiés lorsque les produits de séquençage n’ont pas la séquence cible attendue ou un site DpnII caractéristique d’un fragment 3C approprié (Figure 5). Le séquençage des fragments de PCR fournit également un autre point de données pour l’expérience et fait comprendre aux étudiants que la technique 3C identifie des loci génomiques distants qui se rassemblent dans l’espace 3D dans les noyaux.
La technique 3C fournit une multitude de techniques moléculaires fondamentales pour les étudiants de premier cycle dans une procédure flexible et simple. Cette technique 3C est également un point de départ pour les autres techniques 3C qui intègrent le séquençage de nouvelle génération (NGS). Ces types d’expériences peuvent exposer les étudiants de premier cycle à des aspects importants de la bioinformatique et sont enracinés dans les principes de base décrits ici. L’expérience et la participation au premier cycle sont essentielles à leur succès et à leur développement en tant que jeunes scientifiques. En offrant ces opportunités, les étudiants de premier cycle peuvent renforcer leur compréhension des principes de base tout en renforçant leur confiance pour aborder des techniques et des questions de pointe.

Le génome d’un organisme contient non seulement tous les gènes nécessaires à leur fonctionnement, mais aussi toutes les instructions sur la façon et le moment de les utiliser. Cela fait de la régulation de l’accès au génome l’une des fonctions les plus importantes de la cellule. Il existe de nombreux mécanismes pour contrôler la fonction des gènes; Cependant, à son niveau de base, la régulation des gènes se résume à la capacité des facteurs de transcription régulateurs (trans-facteurs) à se lier à leurs séquences d’ADN spécifiques (séquences cis-régulatrices). Ce n’est pas une capacité innée; Au lieu de cela, il est régi par l’organisation / structure du génome dans le noyau, qui contrôle la disponibilité / exposition des séquences cis-régulatrices aux transfacteurs 1,2,3. Si les transfacteurs ne peuvent pas trouver leurs séquences cis-régulatrices, alors les transfacteurs ne peuvent pas effectuer leurs tâches de régulation. Cela a fait de la compréhension de la façon dont les génomes sont organisés dans le noyau une source importante de recherche.
Il est largement admis que pendant l’interphase, les chromosomes eucaryotes du noyau occupent leur propre domaine ancré à la lame nucléaire et à la matrice nucléaire (Figure 1), faisant ainsi du chromosome plus une tranche de pizza, plutôt qu’une nouille sur une assiette de spaghettis. Les chromosomes sont partiellement condensés par des interactions protéine-ADN (chromatine) qui tordent et bouclent des parties du chromosome. Grâce à la microscopie électronique, à l’hybridation in situ par fluorescence tridimensionnelle de l’ADN (FISH) et aux techniques de marquage de l’ADN (c.-à-d. méthylation fluorescente et artificielle de l’ADN), on a constaté que les domaines inactifs de la chromatine étaient étroitement emballés le long de la périphérie nucléaire 4,5,6, tandis que des portions de chromatine active, moins condensée, se trouvent à l’intérieur du noyau 7,8,9, 10. Ces expériences fournissent une vue d’ensemble de la dynamique chromosomique, mais ne font pas grand-chose pour capturer les changements qui se produisent localement autour des promoteurs de gènes observés dans les études DNase11,12 et nucléosome13,14,15.
La clé pour déverrouiller la dynamique de la chromatine à plus haute résolution a été la formulation de la technique de cartographie chromosomique 3D, 3C. La technique 3C elle-même comprend quatre étapes principales: la réticulation de la chromatine, la digestion de la chromatine par des enzymes de restriction, la ligature de la chromatine et la purification de l’ADN (Figure 2). Les nouveaux fragments d’ADN artificiels générés par ce processus peuvent ensuite être caractérisés pour révéler l’association physique étroite entre des morceaux d’ADNlinéairement éloignés 16. La technique 3C est devenue la base de la création de multiples techniques dérivées qui utilisent les étapes initiales de 3C pour poser des questions plus larges à l’échelle du génome (par exemple, Hi-C, 4C, ChIP-C). Cette famille de techniques 3C a identifié que les chromosomes sont organisés en plusieurs unités discrètes appelées domaines topologiquement associés (TAD). Les TAD sont codés dans le génome et sont définis par des boucles de chromatine flanquées de frontières non bouclées16,17,18,19. Les limites du TAD sont maintenues par deux facteurs évolutifs conservés et omniprésents, y compris le facteur de liaison CCCT (CTCF) et la cohésion, qui empêchent les boucles au sein de TADs distincts d’interagir16,20. Les boucles sont médiées par l’interaction des transfacteurs avec leurs séquences régulatrices, ainsi que par le CTCF et la cohésion21.
Bien que de nombreuses études utilisant les technologies 3C posent des questions générales à l’échelle du génome et utilisent des techniques complexes de collecte d’échantillons, la formulation de la technique 3C est basée sur des techniques de biologie moléculaire de base. Cela rend 3C intrigant pour le déploiement dans les laboratoires de recherche et d’enseignement de premier cycle. La technique 3C peut être utilisée pour des questions ciblées plus petites et est intrinsèquement flexible pour la mise à l’échelle vers le haut ou vers le bas (gènes uniques22, chromosomes16 et / ou génomes18) en fonction de l’objectif et de la direction des questions posées. Cette technique a également été appliquée à une large gamme de systèmes modèles 7,16,19,23 et s’est avérée polyvalente dans son utilisation. Cela fait de 3C une excellente technique pour les étudiants de premier cycle en ce sens que les étudiants peuvent acquérir de l’expérience dans les techniques courantes de biologie moléculaire tout en acquérant une expérience précieuse dans la réponse aux questions dirigées.
Présenté ici est un protocole adapté pour la préparation de la bibliothèque 3C basé sur les protocolesprécédemment publiés 24,25,26,27. Ce protocole a été optimisé pour environ 1 × 107 cellules, bien qu’il ait généré des bibliothèques 3C avec aussi peu que 1 × 105 cellules. Ce protocole s’est avéré polyvalent et a été utilisé pour générer des bibliothèques 3C à partir d’embryons de poisson zèbre, de lignées cellulaires de poisson zèbre et de Caenorhabditis elegans (vers ronds) pour jeunes adultes (YA). Le protocole devrait également être approprié pour les lignées cellulaires de mammifères et, avec une adaptation supplémentaire, la levure.
L’objectif de ces adaptations est de rendre le 3C plus accessible aux étudiants de premier cycle. On a pris soin d’utiliser des techniques semblables à celles qui peuvent être accomplies dans un laboratoire d’enseignement de premier cycle. La technique 3C offre de nombreuses possibilités d’apprentissage aux étudiants de premier cycle pour apprendre les techniques de base de la biologie moléculaire qui bénéficieront à leur développement sur le banc, en classe et dans leurs efforts après l’obtention du diplôme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>215350280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>COEDTAF-RO</td>
			<td>mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td>1 M stock diluted to 500 &#181;M in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl green pyronin&#160;&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>HT70116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>1222530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol-chloroform&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>11459643001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Ready mix (Phire Taq etc)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>KCQS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>108319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

getting an a with the 3cs: chromosome conformation capture for undergraduates

La capture de conformation chromosomique (3C) est un outil puissant qui a engendré une famille de techniques similaires (par exemple, Hi-C, 4C et 5C, appelées ici techniques 3C) qui fournissent des informations détaillées sur l’organisation tridimensionnelle de la chromatine. Les techniques 3C ont été utilisées dans un large éventail d’études, allant de la surveillance des changements dans l’organisation de la chromatine dans les cellules cancéreuses à l’identification des contacts d’amplificateur établis avec les promoteurs de gènes. Alors que de nombreuses études utilisant ces techniques posent de grandes questions à l’échelle du génome avec des types d’échantillons complexes (c.-à-d. analyse de cellules uniques), ce qui est souvent perdu, c’est que les techniques 3C sont fondées sur des méthodes de biologie moléculaire de base applicables à un large éventail d’études. En abordant des questions étroitement ciblées sur l’organisation de la chromatine, cette technique de pointe peut être utilisée pour améliorer l’expérience de laboratoire de recherche et d’enseignement de premier cycle. Cet article présente un protocole 3C et fournit des adaptations et des points d’accent pour la mise en œuvre dans les établissements principalement de premier cycle dans les expériences de recherche et d’enseignement de premier cycle.

An organism&#39;s genome not only holds all the genes required for function but also all the instructions on how and when to use them. This makes regulating access to the genome one of the most important functions of the cell. There are many mechanisms to control gene function; however, at its base level, gene regulation comes down to the ability of regulatory transcription factors (trans-factors) to bind to their specific DNA sequences (cis-regulatory sequences). This is not an innate ability; instead, it is governed by the organization/structure of the genome in the nucleus, which controls the availability/exposure of the cis-regulatory sequences to the trans-factors1,2,3. If the trans-factors cannot find their cis-regulatory sequences, then the trans-factors cannot perform their regulatory tasks. This has made understanding how genomes are organized in the nucleus an important source of inquiry.
It is widely accepted that during interphase, eukaryotic chromosomes in the nucleus occupy their own domain anchored to the nuclear lamina and nuclear matrix (Figure 1), thus making the chromosome more like a slice of pizza, rather than a noodle on a plate of spaghetti. Chromosomes are partially condensed by protein-DNA interactions (chromatin) that twist and loop portions of the chromosome. Through electron microscopy, three-dimensional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA tagging techniques (i.e., fluorescent and artificial DNA methylation), inactive domains of chromatin have been found to be packed tightly along the nuclear periphery4,5,6, while portions of active, less condensed chromatin are found in the interior of the nucleus7,8,9,10. These experiments provide a wide-angle view of chromosome dynamics but do little to capture the changes that occur locally around the gene promotors observed in DNase11,12 and nucleosome13,14,15 studies.
The key to unlocking higher-resolution chromatin dynamics was the formulation of the 3D chromosome mapping technique, 3C. The 3C technique itself comprises four main steps: crosslinking of chromatin, chromatin digestion by restriction enzymes, chromatin ligation, and DNA purification (Figure 2). The new artificial DNA fragments generated by this process can then be characterized to reveal the close physical association between linearly distant pieces of DNA16. The 3C technique became the basis for the creation of multiple spin-off techniques that utilize the initial steps of 3C to ask broader genome-wide questions (e.g., Hi-C, 4C, ChIP-C). This family of 3C techniques has identified that chromosomes are organized into multiple discrete units termed topologically associated domains (TADs). TADs are encoded in the genome and are defined by chromatin loops flanked by unlooped boundaries16,17,18,19. The TAD boundaries are maintained by two evolutionarily conserved and ubiquitous factors, including CCCT binding factor (CTCF) and cohesion, which prevent loops within separate TADs from interacting16,20. The loops are mediated by the interaction of trans-factors with their regulatory sequences, as well as CTCF and cohesion21.
Though many studies using 3C technologies ask broad genome-wide questions and employ complicated sample collection techniques, the formulation of the 3C technique is based on basic molecular biology techniques. This makes 3C intriguing for deployment in both undergraduate research and teaching labs. The 3C technique can be employed for smaller focused questions and is inherently flexible to scaling up or down (single genes22, chromosomes16, and/or genomes18) depending on the focus and direction of the questions asked. This technique has also been applied to a wide range of model systems7,16,19,23 and has been proven to be versatile in its use. This makes 3C an excellent technique for undergraduates in that students can gain experience in common molecular biology techniques while also gaining valuable experience in answering directed questions.
Presented here is an adapted protocol for 3C library preparation based on previously published protocols24,25,26,27. This protocol has been optimized for approximately 1 &#215; 107 cells, though it has generated 3C libraries with as little as 1 &#215; 105 cells. This protocol has proven to be versatile and has been used to generate 3C libraries from zebrafish embryos, zebrafish cell lines, and young-adult (YA) Caenorhabditis elegans (roundworm). The protocol should also be appropriate for mammalian cell lines and, with further adaptation, yeast.
The goal of these adaptations is to make 3C more accessible for undergraduates. Care has been taken to use techniques that are similar to those that can be accomplished in an undergraduate teaching laboratory. The 3C technique provides many learning opportunities for undergraduates to learn basic molecular biology techniques that will benefit their development at the bench, in the classroom, and in their endeavors after graduation.

Pleins feux sur l’auteur : Obtenir un A avec les 3C : Capture de la conformation des chromosomes pour les étudiants de premier cycle  

Obtenir un A avec les 3C: Capture de conformation chromosomique pour les étudiants de premier cycle

Our research aims to uncover how chromatin organization controls gene expression. The focus is on determining what factors regulate chromatin at the gene level to control gene activity. Currently, technologies similar to chromosome confirmation capture, or 3C, are used to make progress in this field.Investments in sample collection and sequencing technologies have pushed us what the 3C techniques can show us. The greatest experimental challenge currently is collecting samples having uniform chromatin architecture. Heterogeneity in samples leads to confounding results.In the future, we'll be focusing on how changes in chromatin organization play a role in cancer.

Cette procédure produira un échantillon expérimental de 3C et deux échantillons témoins (non digérés et digérés). À l’aide de ces trois échantillons, la qPCR a été réalisée. À partir de ces résultats, l’efficacité de la digestion a été calculée (équation 1) et enregistrée (tableau 1). À partir de ces calculs, il a été déterminé que l’échantillon 3C avait une efficacité de digestion d’environ 88% (moyenne du tableau 1) sur les sept loci génomiques testés.
Ensuite, les échantillons ont été testés pour la présence de contacts chromatiniques à longue distance entre les différents loci génomiques en utilisant des combinaisons d’amorces spécifiques aux loci (tableau 2) et qPCR. À l’aide de ces résultats, les abondances de produits par rapport à un ensemble d’amorces témoins ont été calculées (équation 2) et représentées graphiquement à des fins de comparaison (figure 4). Ces données indiquaient que 8 des 10 réactions étaient conditionnelles positives pour les interactions à longue distance.
Les réactions PCR ont ensuite été exécutées sur un gel d’agarose. Le produit PCR attendu pour les huit positifs conditionnels et une réaction négative ont été purifiés sur gel et envoyés pour le séquençage de Sanger. Les résultats pour les réactions positives représentatives (flèche bleue, case bleue) et négatives (flèche rouge, case rouge) sont présentés (figure 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg"> Figure 1 : Structure chromosomique dans le noyau. Organisation chromosomique hypothétique à l’intérieur du noyau. A) Enveloppe nucléaire, lignes noires; B) lame nucléaire, orange; (C) hétérochromatine, lignes compactées; (D) euchromatine, boucles lâches. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg"> Figure 2 : Schéma du protocole 3C. Des portions éloignées de chromosomes linéaires (bleu, jaune et rose) sont rapprochées dans le noyau par des boucles de régulation. (A) Les structures de la boucle sont médiées par des facteurs de transcription (cercle gris et étoile noire); Ces interactions sont préservées grâce à la réticulation chimique. (B) Les boucles sont brisées par digestion enzymatique (lignes noires). (C) Les morceaux de chromatine distants sont ligaturés ensemble par les extrémités collantes créées par la digestion. (D) L’ADN est purifié à partir de protéines. (E) La séquence dans les fragments est identifiée et cartographiée jusqu’au génome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg"> Figure 3 : Le schéma d’amorce 3C. Les amorces 3C sont conçues autour de sites de restriction à différentes distances de l’emplacement génomique d’intérêt. Les flèches roses représentent les ensembles d’amorces expérimentales entourant un site DpnII. Les amorces expérimentales peuvent être mélangées et appariées pour évaluer la boucle de chromatine dans la région. Les amorces orange représentent un contrôle négatif sans site DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg"> Figure 4 : Données représentatives de qPCR pour une expérience 3C. Abondance relative des ensembles d’amorces d’essai 3C. (A) Graphique témoin montrant l’abondance relative du produit dans l’échantillon témoin non digéré (bleu), témoin digéré (gris) et 3C (orange). B) L’expérience 3C; l’abondance relative du produit provenant de combinaisons d’amorces d’essai dans l’échantillon témoin non digéré (bleu), témoin digéré (gris) et 3C (orange). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg"> Figure 5 : Visualisation des produits 3C qPCR. En haut, gel avec les produits de point final qPCR avec les échantillons indiqués. En bas, des fichiers de trace de séquence de Sanger représentatifs pour les réactions indiquées. L’échantillon orange est un exemple de faux positif (voir Figure 4, r38/34), et l’échantillon bleu est un exemple de vrai positif avec le site DpnII indiqué au-dessus de la trace. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Site</td>
			<td>% de digestion</td>
		</tr><tr><td>R8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>R3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>R38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>R34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>R33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>R14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>R47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Efficacité de digestion calculée.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nom</td>
			<td colspan="3">Séquence</td>
			<td>Loci génomiques</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>Amorce de contrôle FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>Amorce de contrôle RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 2 : Amorces pour l’expérience représentative 3C.

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Ici, nous présentons une adaptation de la technique de capture de conformation chromosomique (3C) en détail en mettant l’accent sur la participation et l’apprentissage au premier cycle.

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Notre recherche vise à découvrir comment l’organisation de la chromatine contrôle l’expression des gènes. L’accent est mis sur la détermination des facteurs qui régulent la chromatine au niveau des gènes pour contrôler l’activité des gènes. Actuellement, des technologies similaires à la capture de confirmation chromosomique, ou 3C, sont utilisées pour faire des progrès dans ce domaine.Les investissements dans les technologies de collecte et de séquençage des échantillons nous ont poussé à ce que les techniques 3C peuvent nous montrer. Le plus grand défi expérimental actuel est de collecter des échantillons ayant une architecture chromatine uniforme. L’hétérogénéité des échantillons conduit à des résultats confondants.À l’avenir, nous nous concentrerons sur la façon dont les changements dans l’organisation de la chromatine jouent un rôle dans le cancer.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

2.1K vues.  Bryant University. Notre recherche vise à découvrir comment l’organisation de la chromatine contrôle l’expression des gènes. L’accent est mis sur la détermination des facteurs qui régulent la chromatine au niveau des gènes pour contrôler l’activité des gènes. Actuellement, des technologies similaires à la capture de confirmation chromosomique, ou 3C, sont utilisées pour faire des progrès dans ce domaine.Les investissements dans les technologies de collecte et de séquençage des éch...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Obtenir un A avec les 3C : Capture de la conformation des chromosomes pour les étudiants de premier cycle  

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

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Génétique

Generation and Purification of Chromosome Conformation Capture (3C) Library

On day one after chromatin cross-linking and nuclei collection from 5, 000 young adult Caenorhabditis Elegans worms, transfer the nuclei pellet re-suspended in 450 microliters of clean water to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube. Then add 60 microliters of 10X DPN2 restriction enzyme buffer to it and mix well. Incubate the samples with 15 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate at 37 degrees Celsius for one hour with agitation.Quench the reaction by adding 75 microliters of 20%triton X 100 and incubating as demonstrated previously. Aliquot 10 microliters from the sample, as the undigested control, and store it at four degrees Celsius. After adding 400 units of DPN 2 to the rest of the sample, incubate it overnight at 37 degrees Celsius with agitation for chromatin digestion.On day two, add an additional 200 units of DPN 2 to the sample. To complete the digestion of the cross-linked sample, incubate it at 37 degrees Celsius with agitation for four hours. Heat inactivate the restriction enzyme by incubating the sample for 20 minutes at 65 degrees Celsius.If the enzyme cannot be inactivated by heat, add 80 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate and incubate. Then, add 375 microliters of 20%Triton X 100 to the sample and mix by swirling. Keep aside a 10 microliter aliquot from the sample as the digestion control.For chromatin ligation, transfer the sample to a clean 50 milliliter conical tube. Adjust the sample volume to 5.7 milliliters with molecular grade water and mix by swirling. Then, add 700 microliters of 10 X T4 ligase buffer, followed by 60 units of T4 DNA ligase, and incubate the sample overnight at 16 degrees Celsius.On day three, proceed with protein digestion and reverse cross-linking. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter Proteinase K to the 3C sample and incubate at 65 degrees Celsius overnight with agitation. To begin purification of the 3C library on day four, add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A to the sample and mix by swirling.After incubation, add seven milliliters of phenyl chloroform to the samples and mix by shaking. Centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G and room temperature. Collect and transfer the aqueous phase to a clean 50 milliliter conical tube.Add equal volumes of chloroform and mix the sample by shaking. After centrifuging the sample again as demonstrated, transfer the aqueous phase to another clean 50 milliliter conical tube. Add 7.5 milliliters of molecular grade water, 35 milliliters of 100%ethanol and seven microliters of one milligram per milliliter Glycogen.Freeze the properly mixed sample at minus 80 degrees Celsius. While the sample freezes, begin purifying the control samples by adjusting the volume of the controls to 500 microliters using molecular grade water. Add two microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A and mix by flicking the tube.Next, add one milliliter of phenyl chloroform to the tubes containing the controls and mix by shaking. Centrifuge the tubes. After transferring the aqueous phase to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube, add equal volumes of chloroform.Centrifuge as previously demonstrated before collecting the aqueous phase. To the collected aqueous phase, add one milliliter of ethanol and two microliters of one milligram per milliliter glycogen. After mixing the sample by shaking, incubate it at minus 80 degrees Celsius for 30 minutes.Next, centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G at four degrees Celsius. After removing the supernatant, add 750 microliters of chilled 70%ethanol and centrifuge. Re-suspend the air dried pellet in 50 microliters of molecular grade water.The suspension can be frozen here if not proceeding further immediately. To continue with the 3C sample purification, remove the sample from the freezer and centrifuge at 3, 270 G for 30 minutes. Add 10 milliliters of chilled 70%ethanol and break up the DNA pellet.After centrifuging and removing the supernatant, partially air dry the sample at room temperature. Re suspend the pellet in 150 microliters of 10 millimolar tris HCL at pH 7.5 by pipetting up and down to obtain the purified 3C library. QPCR performed on the one experimental and two control 3C samples helped generate the digestion efficiency data.The 3C sample had an approximately 88%digestion efficiency across the seven genomic loci tested.

Bibliothèque de génération et de purification de la capture de conformation chromosomique (3C)

Identification of the Chromosome Conformation Capture (3C) Products

Take the chromosome confirmation capture or 3C sample and controls, and perform QPCR. Excise the product bands corresponding to the expected fragment size. To perform gel extraction of the PCR products, use a commercial kit or follow the homemade protocol.For the latter, construct a homemade purification cartridge by poking a hole in the bottom of a 0.5 milliliter tube with a needle. Pack a small amount of cotton into the bottom of the tube with the hole, filling no more than half of the tube. Place the tube into a 1.5 milliliter tube, ensuring that the smaller tube rests on the lip of the bigger tube, and not in the tube.Carefully cut the gel fragment into smaller pieces, and place it in the small tube of the cartridge. Place the assembly in a minus 20 degrees Celsius freezer for five minutes. Then, spin the assembly for three minutes at 13, 000 G and room temperature.Discard the small tube containing the agoros debris, and keep the 1.5 milliliter tube with the extracted DNA in the buffer. The samples were tested for the presence of long range chromatin contacts between the different genomic loci, using combinations of loci-specific primers and QPCR. The product abundance is relative to a control primer set were calculated and graft for comparison.The data indicated that 8 of the 10 reactions were conditional positives. Gel purification and sequencing of the expected PCR product for the eight conditional positives and one negative reaction were gel purified and sequenced. The results for representative positive and negative reactions are shown.