Pour commencer, prenez le jeune adulte synchronisé C.Elegans hermaphrodites dans un tube microcentrifugeux. Ajouter 200 microlitres de tampon M9, contenant du poloxamère 188, du pluronic F127 et deux microlitres du réactif du kit de coloration à la pastille de ver. Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pour protéger les colorants de la lumière.
Laisser tourner le mélange à 20 RPM pendant une heure à température ambiante. Ensuite, faites tourner les vers à 500 G pendant une minute. Après cela, retirez la solution de coloration sans déranger la pastille de ver.
Lavez les vers avec un tampon M9 trois fois et transférez-les dans une plaque de gélose NGM ensemencée contenant le traitement approprié. Lavez les vers des plaques dans de nouveaux tubes microcentrifugés avec un millilitre de tampon M9. Ensuite, fixez les vers avec 1% de formaldéhyde sur de la glace pendant 30 minutes.
Et laver les vers avec un millilitre de tampon M9 trois fois pour éliminer tout formaldéhyde résiduel. Après avoir granulé les vers, aspirez la quantité maximale de surnageant, en gardant le granulé intact dans 10 microlitres de M9. Ensuite, pour préparer 2,5% d’agarose, peser 0,125 gramme d’agarose dans un tube à essai en verre borosilicaté de 10 millilitres. Ajouter cinq millilitres de tampon M9 et dissoudre l’agarose en chauffant doucement le tube avec un brûleur bunsen.
Transférer l’agarose fondue dans un bain sec réglé à 75 degrés Celsius. Ajoutez 100 microlitres d’agarose fondue sur un verre de couverture de microscope brillant de pont à l’aide d’une pointe d’un millilitre. Immédiatement, placez une autre lame perpendiculairement sur la goutte d’agarose formant une forme de croix.
Après deux minutes, séparez doucement les lames en poussant le verre du couvercle supérieur en laissant le tampon d’agarose sur la lame du couvercle inférieur. Transférer les vers sur le tampon d’agarose à l’aide d’une pipette en verre Pasteur. Utilisez une mèche faite d’une lingette de laboratoire pour enlever l’excès de liquide.
Ensuite, couvrez les vers avec un bordereau de couverture plus petit et appliquez du vernis à ongles transparent sur la périphérie pour éviter l’évaporation. Placez la lame dans une boîte sombre pour la protéger de la lumière. Utilisez un microscope confocal pour imager les vers dans les 24 heures aux longueurs d’onde appropriées à l’aide d’une lentille grossissante 60 fois.
Ensuite, ouvrez le logiciel d’imagerie et faites un clic droit sur la zone grise. Dans la fenêtre contextuelle qui s’affiche, sélectionnez acquisition. Ti2 pad complet.
Acquisition ND et tables de correspondance. Sous Ti2 full pad, sélectionnez 60 fois et ajustez le bouton de mise au point fine du microscope pour mettre les vers au point. Sélectionnez ensuite le disque rotatif et choisissez l’option 16 bits-pas de classage.
Pour chaque filtre à fluorescence, réglez le temps d’exposition sur 500 millisecondes et 20 millisecondes pour le champ clair. Une fois ces paramètres définis, sélectionnez Exécuter maintenant et attendez que l’image de sortie soit générée en tant que fichier ND2.
