Après avoir créé l’imagerie du C.elegane traité par le médicament, ouvrez le fichier ND dans le serveur d’image J avec le plugin de colocalisation et sélectionnez l’option de fractionnement des images dans la boîte de dialogue. Chaque fichier ND contient des plans d’image pris à trois longueurs d’onde et de la lumière visible. Travaillez avec des images en fond clair, vertes et rouges.
Générez des doublons de ces images pour garder l’image originale intacte en cliquant sur l’image et en sélectionnant Dupliquer ou en utilisant le raccourci clavier shift plus D.Ensuite, réduisez l’arrière-plan en générant un autre doublon d’image comme illustré précédemment. Soustrayez l’arrière-plan avec un rayon de roulement de 100 et sélectionnez l’option Créer un arrière-plan pour générer une image avec l’arrière-plan de l’image donnée. Maintenant, allez au processus, cliquez sur calculatrice d’image et soustrayez la première image dupliquée de la deuxième image dupliquée.
Utilisez les images résultantes pour l’analyse de colocalisation. Pour utiliser le plugin de colocalisation, convertissez les images des canaux vert et rouge en huit bits en cliquant sur image, en sélectionnant type, suivi de huit bits. Ensuite, cliquez sur plugins et sélectionnez colocalisation.
Pour mesurer la colocalisation des mitochondries et des signaux lysosomes, définissez le rapport à 75%, le seuil du canal rouge à 80,0 et le seuil du canal vert à 50,0. Une image binaire huit bits contenant des puncta colocalisés et combinant les trois images huit bits dans une image RVB est générée en sortie. Ensuite, concentrez-vous sur la puncta dans le muscle de la paroi du corps des vers en sélectionnant manuellement la zone et en créant un masque en cliquant sur modifier, sélectionner et créer un masque pour sélectionner la région d’intérêt.
Pour sélectionner les particules dans la région d’intérêt, utilisez la calculatrice d’images pour sélectionner les images colocalisées à huit bits et masquées. Utilisez l’opération et sélectionnez la puncta dans la région d’intérêt générant une image avec puncta dans la région d’intérêt. Enfin, pour analyser la zone des mitochondries et des lysosomes colocalisés, sélectionnez analyser, puis analyser les particules et mesurer la somme des puncta entre 0,1625 micromètre carré et quatre micromètres carrés.
Les images confocales des muscles de la paroi de la tête et du corps des vers ont montré la colocalisation des mitochondries et des lysosomes. Le VL-850 a induit une mitophagie robuste dans les muscles de la paroi du corps de la tête du ver, indiquant un puissant inducteur de mitophagie. La puissance mitophagique du VL-850 était similaire à celle du FCCP.
