Commencez par mélanger 200 microlitres de milieux sériques réduits avec deux microgrammes d’ADN plasmidique séparément dans un tube de microcentrifugation stérile. Répétez cette opération pour deux autres plasmides dans des tubes séparés. Ensuite, dans le nouveau tube deux, mélanger 200 microlitres de milieu sérique réduit avec six microlitres de réactif de transfection et mélanger le contenu par pipetage.
Incuber les tubes pendant cinq minutes à température ambiante avant de mélanger le contenu du tube deux au tube un. Dans des tubes séparés, répétez le mélange des deux autres plasmides avec un réactif de transfection. Incuber le mélange pendant 20 minutes à température ambiante.
Ensuite, goutte à goutte, ajoutez les complexes de transfection aux antennes d’imagerie ensemencées par culture cellulaire HeLa, assurant une répartition égale sur l’ensemble du plat. Une heure avant l’imagerie, ouvrez la valve du réservoir de dioxyde de carbone et allumez le contrôleur environnemental du microscope. À l’aide des flèches haut et bas du pavé tactile, réglez la température à 37 degrés Celsius et le dioxyde de carbone à 5 % Appuyez sur Définir lorsque vous avez terminé.
Pour régler les paramètres du laser, allumez le laser à lumière blanche en cliquant sur l’onglet Acquérir et en sélectionnant Ouvrir la vue d’ensemble du laser. Dans la boîte de dialogue, activez le laser à lumière blanche. Entrez la puissance laser comme 85%Cliquez sur le bouton de commande d’excitation et sélectionnez la puissance maximale dans le menu déroulant.
Commencez le percolate d’ester éthylique de tétraéthyl rhodamine ou TMRE, expérimentez en réglant le laser d’excitation à 514 nanomètres et la fenêtre des spectres d’émission à 524 à 545 nanomètres pour YFP. Ensuite, pour MitoTracker Deep Red, réglez le laser d’excitation sur 641 et la fenêtre des spectres d’émission sur 650 à 750 nanomètres. De même, pour TMRE, réglez le laser d’excitation sur 555 nanomètres et la fenêtre des spectres d’émission sur 557 à 643 nanomètres.
Commencez le paramètre d’acquisition d’image en sélectionnant l’onglet Acquisition et en ajustant le format à 1024 par 1024. Ajustez la vitesse à 600 dans le menu déroulant. Cliquez ensuite sur le bouton Line Average (Moyenne des lignes) et, dans le menu déroulant, sélectionnez-en trois.
Activez le balayage bidirectionnel et réglez le facteur de phase et de zoom sur 22,61 et 1,50 respectivement. Une fois cela fait, sélectionnez les cellules en fonction du signal fluorescent YFP en cliquant sur le paramètre YFP et en appuyant sur Fast Live. Ajustez ensuite le gain et l’intensité de YFP, puis sélectionnez les cellules en fonction du signal fluorescent YFP.
Pour imager la plaque de contrôle DMSO dans l’expérience TMRE, ajustez le gain et l’intensité du réglage du signal TMRE deux de sorte que l’intensité du réseau mitochondrial soit juste en dessous de la saturation. Maintenez le gain et l’intensité de l’EMTC constants. Ajustez ensuite le gain et l’intensité du réglage MitoTracker afin que le réseau mitochondrial soit visible, mais faible.
Une fois les réglages de gain et d’intensité terminés, cliquez sur Démarrer pour acquérir une image. Acquérir des images de 20 cellules par condition expérimentale.
