Pour mesurer l’intensité de fluorescence des cellules HeLa transfectées dans le logiciel ImageJ, cliquez sur Fichier et sélectionnez Ouvrir. Dans la boîte de dialogue, sélectionnez les fichiers d’imagerie pour l’expérience et cliquez sur OK. Une fois que la fenêtre des options d’importation des bioformats apparaît, sélectionnez les canaux fractionnés et cliquez sur OK.
Dans les expériences de tétraméthylrhodamine, d’ester éthylique, de perchlorate ou de TMRE, YFP est le premier canal, MitoTracker est le deuxième canal et TMRE est le troisième canal. Ajustez la luminosité en sélectionnant l’image, puis ajustez et enfin la luminosité. Ensuite, chargez la région d’intérêt enregistrée ou le ROI en cliquant sur analyser, puis sur outils, puis sur Gestionnaire de retour sur investissement.
Dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur plus, puis ouvrez dans la liste et sélectionnez le retour sur investissement enregistré. Mesurez ensuite l’intensité fluorescente de cinq régions aléatoires dans une seule cellule en sélectionnant le retour sur investissement enregistré dans le gestionnaire de retour sur investissement et en déplaçant le retour sur investissement vers un emplacement aléatoire dans une cellule. Pour mesurer l’intensité de fluorescence, appuyez sur M sur le clavier et répétez cette opération avec quatre régions supplémentaires qui ne se chevauchent pas.
Lorsqu’une boîte de dialogue avec les valeurs de zone et de gris moyen s’affiche, copiez et collez les valeurs dans une feuille de calcul pour analyse. Les résultats pour les intensités de fluorescence TMRE et MitoSOX ont montré que leur traitement avec l’agent de découplage connu CCCP diminuait l’intensité de fluorescence TMRE par rapport aux conditions témoins. De plus, le traitement CCCP micromolaire 20 a induit la production de superoxyde et a augmenté l’intensité de fluorescence MitoSOX.
Dans des conditions de stress CCCP léger ou à cinq micromolaires, l’expression de Parkin de type sauvage et de Parkin T240R a entraîné une intensité TMRE plus élevée par rapport au vecteur de contrôle YFP vide. L’intensité de MitoSOX était plus faible dans les cellules exprimant Parkin de type sauvage et Parkin T240R par rapport aux cellules exprimant le vecteur de contrôle YFP, ce qui suggère que l’expression de Parking aide à maintenir la santé du réseau mitochondrial en préservant des potentiels membranaires mitochondriaux plus élevés et de faibles niveaux de superoxyde.
