Utilisez un chandelier à œufs pour tracer le long du périmètre de la poche d’air au-dessus de l’embryon E14 ou E15 avec un crayon et couvrez la zone délimitée avec du ruban adhésif transparent. À l’aide de ciseaux incurvés ou fins, coupez doucement autour de la zone tracée. Veillez à ne pas couper dans la membrane embryonnaire ou les vaisseaux sanguins.
Jetez ensuite la partie supérieure de la coque. Après avoir décapité l’embryon de poussin, placez la tête dans un plat de 10 centimètres avec une solution froide et stérile de FMC. À l’aide de pinces fines stériles, retirez la peau qui recouvre le cerveau pour révéler la dure-mère sous-jacente.
Enlevez les os du crâne en formation sur les côtés gauche et droit du cerveau. Les os du crâne en formation ne couvrent pas encore la majorité du cerveau. Utilisez doucement des pinces fines et pointues pour déchirer les méninges, recouvrant le centre du cerveau et pelez-le de chaque côté pour découvrir le cerveau.
À l’aide de fines pinces incurvées, ramassez le cerveau par le bas vers le haut et retirez-le doucement de sa cavité. Disséquer le cerveau en ses trois parties principales du cerveau antérieur, du mésencéphale ou du tecta optique et du cervelet. Retirez la pie-mère sus-jacente du tecta à l’aide de pinces fines et placez les régions cérébrales disséquées dans une petite boîte stérile sur de la glace.
Pour encastrer et trancher le cerveau, prenez doucement le tectum optique ou la région du cerveau antérieur avec une pince incurvée comme une cuillère et épongez légèrement sur la gaze stérile pour éliminer le liquide supplémentaire. Préparez un moule simple en formant une feuille d’aluminium autour d’un objet de taille appropriée. Ici, un petit bloc de trancheur de tissu vibrant métallique rectangulaire est utilisé comme objet.
Utilisez une pipette de transfert stérile et remplissez le moule d’agarose à bas point de fusion. Placez rapidement la région du cerveau dans l’agarose et laissez-la se solidifier pendant environ quatre à cinq minutes sur la glace. Couper les sections sur une trancheuse à papier vibrant à l’aide d’un couteau en saphir.
Utilisez la spatule stérile pour ramasser et retirer la tranche du plateau. Faites glisser doucement la section hors de la spatule et sur un insert à membrane à l’aide d’une autre spatule stérile. Placez les six plaques de puits de tranches de cerveau sur des inserts membranaires dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain du placage, utilisez une pipette Pasteur stérile pour aspirer le média sous l’insert et ajoutez un millilitre de fluide en tranches fraîches à chaque puits sous l’insert à membrane. Ensuite, pour introduire les cellules GBM sur les tranches de cerveau, retirez un à plusieurs sphéroïdes de leur plat de culture à l’aide d’une micro-pipette de 20 microlitres réglée sur cinq microlitres. Expulser doucement le milieu avec des sphéroïdes sur la tranche de cerveau désirée et laisser les sphéroïdes se cultiver sur la tranche pendant deux à cinq jours.
Les résultats de viabilité des tranches de tectum optique x vivo après une semaine de culture sont présentés dans cette figure. Les images confocales d’une tranche de cerveau colorée pour les noyaux avec du bisbenzimide et immunocolorée pour la laminine montrent clairement des vaisseaux sanguins normaux et intacts sectionnés optiquement dans diverses configurations. L’image de projection maximale de la pile confocale Z de la tranche cérébrale colorée pour le facteur de transcription SOX 2 et les noyaux totaux avec bisbenzimide est montrée ici.
Ces résultats suggèrent que les tranches de cerveau d’embryon de poussin pourraient être cultivées sur des inserts membranaires pendant environ deux semaines et rester viables avec des vaisseaux sanguins d’apparence normale et une expression du facteur de transcription.
