Après avoir fixé le globe oculaire énucléé de la souris euthanasiée, transférez-le sur une lame de verre et placez-le sous un microscope à dissection. À l’aide de pinces, serrez la marge de la cornée pour empêcher le mouvement du globe oculaire. Avec les ciseaux à dissection, coupez autour de la cornée à une profondeur d’environ un millimètre à travers le limbe scléral de la cornée, puis retirez le cristallin et le corps vitré.
En tenant le disque optique au centre, coupez la rétine radialement le long des quatre quadrants, atteignant environ 2/3 du rayon de la rétine. Serrez l’un des bords scléraux à l’aide d’une pince dentée. Tenez le bord de la sclérotique avec une pince non dentée et déplacez-vous de la pince dentée vers la base de la sclérotique.
Pelez soigneusement la rétine. Mouillez la rétine avec 200 microlitres de PBS à l’aide d’une pipette. Enlevez l’excès de PBS à l’aide de papier absorbant et aplatissez la rétine avec une petite brosse à poils si nécessaire.
Ajouter lentement du méthanol froid goutte à goutte sur la surface interne de la rétine jusqu’à ce qu’elle se couvre complètement. Une fois que la rétine devient blanche et développe une ténacité accrue, aplatissez doucement la rétine et éliminez les impuretés, telles que les membranes pigmentaires résiduelles et le corps vitré, avec une petite brosse à poils. Après avoir inversé la rétine, traitez-la avec du méthanol comme démontré précédemment, et transférez-la dans un puits de plaque de 24 puits, trempez-la dans du méthanol et stockez-la à 20 degrés Celsius pendant une à deux heures pour une immunomarquage immédiate.
Ensuite, rincez la rétine avec du PBS après avoir retiré le méthanol de la plaque. Les cellules ganglionnaires du rétinol des rétines avant et après le traitement au méthanol ont été visualisées par microscopie confocale, ce qui a indiqué que les 12 mois de conservation du méthanol n’affectaient pas l’immunomarquage du CGR.
