Commencez par placer une souris enceinte sacrifiée sur le dos sur une planche de dissection. À l’aide d’une pince, pincez la ligne médiane abdominale. Avec une paire de ciseaux tranchants, couper l’abdomen à travers la peau et le péritoine des organes génitaux à la cage thoracique sur la ligne médiane.
Retirez l’utérus contenant les embryons et placez-le immédiatement sur de la glace. Coupez soigneusement à travers le sac vitellin sur les côtés placentaires et retirez les embryons. Ensuite, placez les têtes embryonnaires décapitées dans une boîte glacée contenant du HBSS déficient en calcium et en magnésium.
Placez la tête dans un plat de 35 millimètres orienté vers la gauche. Percez un œil avec le bord de la pince, en tenant fermement le menton avec l’autre. Déchirez doucement la peau du cuir chevelu de la nuque le long de la ligne médiane vers le museau.
Utilisez les pinces inclinées pour entrer par la moelle épinière ovale blanche et ouvrir le crâne le long de la ligne médiane, exposant ainsi le cerveau. Décollez doucement le crâne des côtés. Ensuite, soulevez le cerveau hors du crâne et jetez le crâne.
Utilisez des forceps pour enlever les méninges. Placez le cerveau dans un bijou contenant deux millilitres de HBSS déficient en calcium et en magnésium. Ajouter 250 microlitres de trypsine 10X au bijou.
Triturer le cerveau en secouant le bijou puis incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, ajoutez deux millilitres d’inhibiteur de trypsine de soja à chaque bijou. Agiter pour disperser l’inhibiteur uniformément.
Sans centrifugation, transférer deux millilitres du surnageant de chaque bijou dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. À l’aide d’une aiguille de calibre 19 fixée à une seringue de cinq millilitres, aspirer la suspension deux fois pour triturer les cellules restantes dans le bijou. Répétez l’aspiration deux fois avec une aiguille de calibre 21.
À l’aide d’une aiguille de 23 G, transférer les cellules du bijou dans le tube à centrifuger de 15 millilitres contenant le surnageant cellulaire et centrifuger à 200 g pendant cinq minutes à température ambiante. À l’aide d’une pipette sérologique de cinq millimètres, transférer tout le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres sans perturber la pastille. Répéter la centrifugation.
Ajouter 10 millilitres de média de placage dans un tube contenant les pastilles combinées des deux étapes de centrifugation et bien mélanger pour créer une suspension entière. Colorez les cellules avec du bleu de trypan et comptez à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules. Plaquer les cellules en ajoutant le volume requis de la suspension de cellules cérébrales embryonnaires E17 murines dans une plaque de puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius sous 5 à 7% de dioxyde de carbone pendant deux à quatre heures. Après avoir retiré le média, ajoutez un nouveau média de différenciation à chaque puits. Appuyez sur les glissements de couvercle flottants à l’aide d’un embout de pipette stérile.
Maintenir les cultures en enlevant une partie du surnageant et en la remplaçant par de nouveaux milieux de différenciation trois fois par semaine. Les cultures ont été visualisées par coloration par immunofluorescence pour NG2 et nestine comme marqueurs de développement, SMI31, MBP et NeuN comme marqueurs neuronaux, et CNP, GFAP et Iba1 comme marqueurs gliaux L’infection des cultures par le virus neurotrope Semliki Forest a affecté les oligodendrocytes et les neurones. Les études qRT-PCR des cellules infectées ont démontré une régulation positive de l’ARNm de la cytokine chimiotactique Ccl5 dans des cultures traitées à l’interféron bêta.
Les études ELISA ont montré une augmentation de Ccl5 dans le surnageant, montrant ainsi une corrélation entre l’ARNm et l’expression des protéines. Les études de cytométrie en flux de suspension unicellulaire ont montré que 70% des cellules restaient viables. Un grand nombre de microglies, de neurones et d’astrocytes étaient présents, tandis que les oligodendrocytes étaient les moins abondants.
