Commencer par aspirer le milieu des plaques contenant du 264,7 brut adhérent. Ajouter 10 millilitres de PBS par plaque de 15 centimètres. Utilisez un grattoir de cellules pour détacher les cellules et les tirer dans un seul tube de 50 millilitres.
Pipeter la suspension cellulaire de haut en bas pour homogénéiser. Ensuite, transférez 5% du volume de suspension de la cellule dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Centrifuger à 300G pendant cinq minutes à température ambiante.
Jeter le surnageant et placer la pastille de fraction cellulaire totale sur de la glace. Après avoir centrifugé la suspension restante comme décrit précédemment, aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de tampon mitochondrial glacé. Centrifuger la suspension à 300G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Re-suspendre la pastille dans 0,5 millilitre de tampon mitochondrial froid. Et transférez la suspension dans un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, homogénéisez la suspension, en la contournant 30 fois à l’aide d’une aiguille de calibre 25 fixée à une seringue d’un millilitre.
Ajoutez ensuite un millilitre de tampon mitochondrial froid dans le tube et mélangez par inversion. Après avoir centrifugé les cellules, transférer un millilitre du surnageant dans un tube frais sur de la glace. Re-suspendre la pastille dans le tampon et homogénéiser la pastille en passant à travers une aiguille de calibre 25 montée sur une seringue d’un millilitre.
Tirez les pastilles de cellules homogénéisées et le surnageant des étapes précédentes dans un seul tube de 1,5 millilitre. Centrifugez-le à 2 000 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant et divisez-le en quatre tubes de 1,5 millilitre.
Porter le volume de chaque tube à 1,5 millilitre à l’aide d’un tampon mitochondrial. Retourner les tubes pour mélanger leur contenu, puis centrifuger les tubes. Retirez délicatement le surnageant et la pastille cellulaire blanche supérieure.
Gardez l’un des quatre tubes contenant la pastille mitochondriale brune sur de la glace comme fraction mitochondriale brute. Tirez les pastilles restantes dans un nouveau tube et faites le volume final un millilitre avec un tampon mitochondrial. En utilisant ce protocole, les cellules totales et les fractions mitochondriales brutes ont été obtenues à partir de la lignée cellulaire de macrophages bruts 264.7 et de la BMDM.
L’analyse immuno-sanguine a montré que la citrate synthase mitochondriale était enrichie en fraction brute. Les protéines du cytosol, de la membrane plasmique, du noyau, du lysosome et du réticulum endoplasmique ont disparu. L’analyse du protéome a montré un enrichissement de plus de dix fois dans la fraction brute.
Les six autres compartiments cellulaires ont été épuisés pendant la purification.
