Préparez-vous à l’immunomarquage en disséquant la strie vasculaire de la souris et ajoutez le tissu dans une plaque de 24 puits contenant 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4% dans 1X PBS. Incuber le tissu pendant 20 minutes à température ambiante. effectuer deux courts lavages de 1X PBS sur un agitateur orbital à bas régime.
Retirez le PBS, puis effectuez la perméabilisation et le blocage pendant au moins une heure à température ambiante dans 300 microlitres de solution PBST. Ensuite, colorez le tissu avec l’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite un anticorps secondaire et incuber pendant deux heures à température ambiante sur un agitateur orbital à bas régime.
Couvrir la plaque pour protéger de la lumière l’anticorps secondaire marqué par fluorescence. Ensuite, préparez une microlame plus grande en plaçant deux petites traînées de colle le long de l’axe de 25 mm, juste plus petites que le couvercle en verre de 18 par 18 millimètres. Placez une goutte de réactif de montage entre les traînées de colle.
À l’aide d’une pince numéro 55, utilisez le moins de tissu possible à une extrémité du SV et transférez-le du PBS au réactif de montage. Placez une extrémité du couvercle sur la glissière où une traînée de colle a été placée. Relâchez ensuite doucement le couvercle pour éviter de créer des bulles d’air.
Scellez le support en tamponnant une goutte de vernis à ongles transparent sur chaque coin du support. Étiquetez l’échantillon sur le couvercle en verre, loin du champ de visualisation. Visualisez le tissu SV sous un microscope à dissection pour vous assurer qu’il est à plat et non près de bulles d’air.
Si le tissu SV n’est pas orienté correctement, essayez d’expulser les bulles d’air ou retirez soigneusement le plus petit couvercle en verre et repositionnez le SV. Une monture entière de SV de souris P30 a été préparée et une imagerie confocale a été réalisée. L’expression de ZsGreen a été observée dans les cellules intermédiaires, les cellules endothéliales marquées par GSIB4 et les noyaux marqués par DAPI.
