Fresh Primary Tumor Tissue Processing to Establish Tumor Organoids and Primary Fibroblasts

Commencez par placer le tissu dans une plaque de culture tissulaire stérile et retirez l’excès de milieu. Mesurez le tissu à l’aide d’une règle métallique stérile et photographiez-le. Ajoutez trois millilitres de milieu DMEM/F-12 avancé au tissu coupé et pipetez le tissu de haut en bas pour le laver.

Lavez ensuite le mouchoir avec trois millilitres de PBS. Aspirez le milieu de la plaque de culture tissulaire et coupez-le en petits morceaux à l’aide de lames stériles et de deux millilitres de milieu de digestion. Ensuite, collectez le tissu dans un tube de 50 millilitres contenant cinq millilitres au total du milieu digestif.

Incubez le tube à 37 degrés Celsius pendant une heure. Mélangez périodiquement la suspension en pipetant de haut en bas. Inactivez la trypsine en ajoutant cinq millilitres de DMEM/F-12 avancé dans le tube.

Filtrez ensuite l’échantillon à travers une crépine de pores de 70 micromètres pour éliminer les gros débris. Maintenant, pipetez deux millilitres de DMEM contenant 10% FBS sur le dessus du filtre et utilisez une pipette pour collecter les débris et les restes de tissus pour la culture des fibroblastes. Ensuite, plaquez les débris pour la culture des fibroblastes.

Centrifuger le filtrat à température ambiante à 200 à 300 G pendant cinq minutes, puis aspirer le surnageant. Ajoutez cinq millilitres de DMF 12 avancé à la pastille et centrifugez à nouveau la suspension à 300 G pendant cinq minutes. Pour la lyse des globules rouges, remettre la pastille en suspension dans quatre millilitres de tampon de lyse de potassium au chlorure d’ammonium et la transférer dans un tube de 15 millilitres.

Incubez les cellules à température ambiante pendant deux minutes. Après avoir centrifugé le mélange dans les mêmes conditions que celles démontrées précédemment, aspirer le surnageant. À la pastille, ajoutez cinq millilitres de DMEM/F-12 avancé et centrifugez à nouveau à quatre degrés Celsius.

Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez un millilitre de réactif de dissociation cellulaire disponible dans le commerce à la pastille et incubez-la pendant deux à trois minutes à température ambiante. Après incubation, centrifuger et aspirer à nouveau le surnageant. Ensuite, remettez le plomb en suspension dans cinq millilitres de DMEM/F-12 avancé.

Dissociez les amas cellulaires en pipetant la suspension plusieurs fois avec une pipette P1000. Centrifuger la suspension et retirer le surnageant. Ensuite, procurez-vous des pointes de pipette P1000 et P200 pré-refroidies, et utilisez les pointes froides fixées sur la pipette P1000 pour remettre en suspension la pastille cellulaire dans la matrice membranaire, avant de placer le Falcon sur de la glace pour éviter la solidification.

Procurez-vous la plaque préchauffée de l’incubateur. À l’aide du jeu de pipettes P200 de 48 microlitres et à l’aide de pointes froides, créez des dômes de matrice de membrane basale dans la plaque préchauffée. Ensuite, incubez-le pour solidifier le mélange de membrane basale.

Une fois la matrice solidifiée, ajoutez deux à deux millilitres et demi de DMEM/F-12 avancé, complété par les facteurs de croissance et les inhibiteurs. Les cellules tumorales ont été isolées et les organoïdes tumoraux ont été établis à partir de tissus frais sur une période de 15 jours. Parfois, de grands volumes de débris cellulaires empêchent une visualisation précise des organoïdes tumoraux en développement.

On a observé que les organoïdes en développement variaient phénotypiquement de cultures isolées, arrondies à sphéroïdes ou agrégées, en fonction de l’origine de la tumeur. Les cultures d’organoïdes peuvent être contaminées par des fibroblastes, un produit IP commun de la culture de cellules tumorales primaires. Après environ sept jours de culture, les fibroblastes migrent des dômes de la matrice de la membrane basale et adhèrent aux plaques cellulaires, ce qui peut compromettre la croissance optimale des organoïdes.

Les cultures de fibroblastes sont établies à partir des débris tissulaires récupérés du filtre. Les cellules migrent hors des débris tissulaires et adhèrent aux plaques de culture.