Pour commencer, éteignez la lumière de la pièce. Sélectionnez Oculaire sous le panneau oculaire dans le logiciel FlowView. Changez la tourelle cubique en quatre TRITC, et éteignez le contrôleur de l’écran tactile en cliquant sur le rétroéclairage du contrôleur de l’écran tactile dans le logiciel.
Éteignez ensuite l’écran de l’ordinateur. Ouvrez la face avant du couvercle en tissu noir sur le microscope. Prenez la boîte à fond de verre de 35 millimètres contenant les embryons de la boîte noire et placez-la sur la platine du microscope.
Allumez ensuite l’unité d’éclairage par fluorescence et utilisez l’oculaire pour identifier l’embryon d’intérêt. Mettez-le au point. Fermez le couvercle en tissu noir pour protéger l’échantillon de la lumière.
Allumez l’écran de l’ordinateur pour accéder au logiciel qui contrôle le microscope. Changez l’oculaire en LSM dans le logiciel pour l’acquisition d’images. Effectuer l’ablation au laser dans des embryons témoins non stimulés à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau à un grossissement de 25 fois.
Cliquez sur Bright Z, Sequence Manager et LSM stimulation dans la fenêtre de l’outil. Définissez le type de scanner sur Galvano et la taille de numérisation sur 512 x 512. Activez le canal un et le canal trois sous le panneau de réglage PMT pour permettre l’utilisation du laser de 1040 nanomètres, et cliquez en direct quatre fois la vitesse pour visualiser l’embryon.
Faites pivoter l’embryon à l’aide de la fonction de rotation pour orienter verticalement l’axe antérieur postérieur et réglez le zoom sur trois. Dessinez une région d’intérêt ou un retour sur investissement à l’aide de l’outil de forme sous les paramètres de numérisation, puis définissez la taille du retour sur investissement dans le panneau de référence. Ensuite, définissez le retour sur investissement sur 512 pixels en largeur et 100 pixels en hauteur.
Pour définir les paramètres d’acquisition de la pile Z de pré-ablation, enregistrez la surface de l’embryon comme nulle sous la section Z. Définissez le début sur zéro et la fin sur 100 micromètres. Définissez la taille du pas sur deux micromètres et activez le mode d’acquisition Z en cochant Z sous l’onglet Série.
À l’aide de la fonction Z lumineuse, réglez l’intensité laser de 1040 nanomètres pour augmenter linéairement de 3 % à 7 %Enregistrez le paramètre d’imagerie actuel en tant que première tâche du pipeline en cliquant sur LSM dans le Gestionnaire de séquences. Pour définir les paramètres d’acquisition du film de pré-ablation, définissez un retour sur investissement de 512 x 512 pixels près de la surface ventrale de l’embryon, comme démontré précédemment. Réglez l’intensité laser de 1 040 nanomètres sur 3 %Vérifiez l’heure, puis décochez Z sous le panneau de la série.
Conservez l’intervalle en mode libre sous le panneau Time Lapse et réglez le cycle sur 10. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans le Gestionnaire de séquences. Pour définir les paramètres de l’ablation laser, définissez une région 3D immédiatement sous la membrane vitelline.
Définissez le début de la pile Z comme plan et la fin comme 20 micromètres plus profonds. Définissez la taille du pas sur 1,5 micromètre. Activez les canaux deux et quatre sous le panneau de réglage PMT pour permettre l’utilisation du laser de 920 nanomètres.
Réglez l’intensité du laser sur 30 % et réglez l’acquisition d’images avec le laser pour une seule pile Z dans la région 3D définie. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans le Gestionnaire de séquences. Pour définir les paramètres d’acquisition du film post-ablation, réglez l’acquisition d’image pour un film post-ablation à plan Z unique de 100 images à l’aide des lasers de 1, 040 et 920 nanomètres.
Réglez l’intensité des lasers sur 3 % et 0,3 %Enregistrez le réglage actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans le Gestionnaire de séquences. Sélectionnez la séquence sous Acquérir. Modifiez le chemin d’enregistrement des données et le nom du fichier selon vos besoins.
Cliquez sur Prêt et attendez que le logiciel initialise le pipeline, puis cliquez sur Démarrer pour exécuter le pipeline. pour effectuer l’ablation au laser dans les embryons stimulés, Définir les paramètres d’acquisition pour la pile Z pré-ablation, comme démontré pour les embryons non stimulés. Enregistrez le paramètre actuel en tant que première tâche du pipeline en cliquant sur LSM dans le Gestionnaire de séquences.
Pour définir les paramètres de la stimulation optogénétique dans le cadre d’un ROI défini, définissez le zoom sur un zoom et sélectionnez un ROI qui couvre la surface ventrale de l’embryon. Éteignez les détecteurs du canal un au canal quatre, cliquez sur Stimulation LSM, décochez la case Continu pendant la durée et tapez 12 secondes. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur stimulation dans le Gestionnaire de séquences.
Définissez un temps d’attente de trois minutes après la stimulation pour assurer l’inactivation totale de la myosine et le désassemblage apical de la F-actine et obtenir une morphologie tissulaire statique avant l’ablation au laser. Ensuite, définissez les paramètres d’acquisition pour le film de pré-ablation à plan Z unique, comme démontré pour les embryons non stimulés, sauf que les lasers de 1 040 et 920 nanomètres sont utilisés pour l’acquisition d’images. Allumez les détecteurs du canal un au canal quatre.
Réglez l’intensité des lasers sur 3 % et 0,3 %Enregistrez le réglage actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans le Gestionnaire de séquences. Définir les paramètres de l’ablation au laser tels qu’ils ont été démontrés pour les embryons non stimulés. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans le Gestionnaire de séquences.
Définir les paramètres d’acquisition pour le film post-ablation à plan Z unique, comme cela a été démontré pour les embryons non stimulés. Enregistrez le paramètre actuel en tant que tâche suivante du pipeline en cliquant sur LSM dans le Gestionnaire de séquences. Sélectionnez la séquence sous Acquérir.
Modifiez le chemin d’enregistrement des données et le nom du fichier selon vos besoins. Cliquez sur Prêt et attendez que le logiciel initialise le pipeline, puis cliquez sur Démarrer pour exécuter le pipeline. Dans les embryons non stimulés subissant une constriction apicale, la courge spaghetti mCherry s’est enrichie au niveau de la région apicale médiale, tandis que la mCherry négative dominante de CRY2Rho était cytosolique.
Dans les embryons stimulés, le signal négatif dominant de CRY2Rho mCherry est devenu localisé dans la membrane plasmique, tandis que le signal apical médial de la courge spaghetti mCherry a complètement disparu. L’ablation au laser des embryons non stimulés dans le domaine de constriction a conduit à un recul rapide des tissus le long de l’axe antérieur postérieur, tandis que l’ablation au laser dans les embryons stimulés n’a pas entraîné de recul tissulaire notable. L’ablation a été quantifiée et montrée ici.
