Pour commencer, prélevez l’échantillon de tissu clinique archivé ou frais digéré et élargi et procédez à la coloration des anticorps en le plaçant dans un seul puits d’une plaque de culture cellulaire à six puits. Lavez l’échantillon trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacune à température ambiante. Selon la taille de l’échantillon, ajoutez 0,5 à 2 millilitres d’anticorps primaires dans le tampon de coloration pour couvrir le gel adéquatement.
Incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez l’échantillon trois fois avec du PBS pendant 10 minutes chacune à température ambiante. Ajouter les anticorps secondaires correspondants et incuber pendant trois heures à 37 degrés Celsius dans le tampon de coloration de votre choix.
Relavez l’échantillon comme démontré précédemment et ajoutez 1 à 2 millilitres de polyéthylèneglycol sur l’échantillon dans une plaque à six puits. Colorer l’échantillon avec de l’ester NHS conjugué au fluor 4 pendant trois heures à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver l’échantillon trois fois avec du PBS.
Ensuite, pour effectuer une coloration lipidique, prenez l’échantillon de tissu expansé lavé trois fois dans du PBS, appliquez un colorant lipophile conventionnel dilué 200 fois dans 2 millilitres de 0,1% Triton X-100 ou PBS pendant 72 à 96 heures à température ambiante et lavez au moins trois fois avec du PBS. Pour effectuer FISH, préparez le tampon d’hybridation en combinant 2 x SSC, 10% de sulfate de dextrane, 20% de carbonate d’éthylène et 0,1% de Tween 20. Placer les échantillons de gel homogénéisés dans un tampon d’hybridation préchauffé à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Ensuite, incuber les échantillons de gel avec un tampon d’hybridation contenant 10 sondes FISH picomolar contre le gène cible pendant la nuit à 45 degrés Celsius. Laver les échantillons avec un tampon de lavage de rigueur deux fois pendant 15 minutes chacun à 45 degrés Celsius et deux fois pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Lavez l’échantillon trois fois avec du PBS pendant 10 minutes et procédez à l’imagerie ou à l’entreposage de l’échantillon dans du PBS plus 0,02 % d’azoture de sodium à 4 degrés Celsius.
Pour agrandir complètement et imager le tissu, déplacez les échantillons quadruples dilatés dans PBS vers une plaque d’imagerie à six puits à fond de verre. Si l’échantillon a été élargi davantage, coupez-le en plus petits morceaux. Appliquez 0,1% de polylysine sur la surface du verre.
Placez l’échantillon sur la lame et retirez tout excès de liquide autour du gel avec un chiffon de laboratoire en papier pour empêcher le mouvement du gel pendant l’imagerie. Ensuite, effectuez une imagerie par fluorescence à l’aide d’un microscope à grand champ conventionnel, d’un microscope confocal ou d’un autre système d’imagerie de votre choix. Après l’imagerie, rétrécir les échantillons dans PBS avec au moins trois lavages de 10 minutes, car le stockage à long terme dans l’eau désionisée entraîne une dégradation du signal fluorescent.
Enfin, conservez les échantillons dans du PBS avec de l’azoture de sodium à 0,02% à 4 degrés Celsius. Les images confocales du tissu cérébral de souris entièrement expansé ont permis de visualiser les protéines et les structures membranaires cellulaires et mitochondriales. Les acides nucléiques des tissus ganglionnaires humains formels et fixes incorporés dans la paraffine ont également été identifiés.
Après une expansion de 3,5 fois de la section rénale, le glomérule expansé sans fissure a été observé. Cependant, un ancrage ou une homogénéisation inadéquat a entraîné des fissures, des distorsions et la perte de cibles marquées dans une autre section rénale.
