Pour commencer, inoculer 2 millions de cellules pan02 dans 12 millilitres de DMEM et incuber à 37 degrés Celsius et 95% d’humidité, 5% de dioxyde de carbone et 35% d’air. Après 48 heures, centrifuger la culture à 28 g pendant 2 minutes et jeter le surnageant. Fixez les cellules en ajoutant 1 millilitre de glutaraldéhyde à 2,5% dans les tubes microcentrifugeuses de 1,5 millilitre pendant la nuit à 4 degrés Celsius.
Le lendemain, centrifuger les échantillons à 1006 g pendant cinq minutes et aspirer le fixateur avant de rincer l’échantillon deux fois avec 0,1 molaire PBS. Ensuite, rincer les échantillons deux fois avec de l’eau distillée double pendant 10 minutes chacun. Ensuite, ajoutez une solution de 50 microlitres de tétroxyde d’osmium à 1% et de ferrocyanure de potassium à 1,5% dans un rapport de 1 à 1 et incuber à 4 degrés Celsius pendant 1 heure.
Centrifuger et rincer les échantillons deux fois avec 0,1 molaire de PBS et une fois avec de l’eau distillée double. Ajouter ensuite 1 millilitre de thiocarbohydrazide à 1% et incuber à température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Après incubation, centrifuger et jeter le surnageant avant de rincer les échantillons 4 fois avec de l’eau distillée double.
Ensuite, ajoutez 50 microlitres de tétroxyde d’osmium à 1% et laissez-le fixer à température ambiante pendant 1 heure. Centrifuger à nouveau et rincer les échantillons 4 fois avec de l’eau distillée double. Ajoutez 1 millilitre d’acétate d’uranyle à 2% et laissez-le se colorer à 4 degrés Celsius pendant la nuit.
Après avoir rincé les échantillons avec de l’eau distillée double, ajoutez 1 millilitre de solution Walton et incuber à 60 degrés Celsius pendant une heure. Après l’incubation, rincer les cellules 4 fois avec de l’eau distillée double avant la déshydratation dans une série d’éthanol gradué pendant 10 minutes chacune. Puis déshydrater deux fois dans un millilitre d’acétone à 100% pendant 10 minutes chacun.
Ensuite, mélangez 200 microlitres d’acétone avec de la résine époxy Pon 812 dans un rapport de 3 à 1, 1 à 1 et 1 à 3. Et faire tremper les échantillons dans la résine à température ambiante pendant 2, 4 et 4 heures respectivement Après incubation respective, imprégner les échantillons pendant la nuit dans de la résine époxy 100% Pon 812. Le lendemain, transférez les échantillons dans un moule plat et polymérisez-les dans un four à 60 degrés Celsius pendant 48 heures.
Après polymérisation, à l’aide d’un ultra microtome, recueillir des bandes tranchées en série de 70 nanomètres d’épaisseur sur les plaquettes de silicium hydrolysées et les sécher dans un four à 60 degrés Celsius pendant 10 minutes.
