Coupez un ruban de carbone conducteur et collez-le entre les plaquettes de silicium montées avec des sections de cellules pancréatiques et un étage d’échantillon SEM. Ensuite, réglez la tension d’accélération FESEM sur deux kilovolts avec une distance de travail de quatre millimètres. Dans la barre de menu supérieure, cliquez sur l’icône HL.
Ensuite, à faible grossissement, orientez la première section des bandes de découpe cibles, et, à nouveau, cliquez sur l’icône HL pour passer en mode de grossissement élevé. Collectez une image appropriée pour la structure d’intérêt en ajustant la luminosité, le contraste et l’agrandissement de l’image. Ensuite, sélectionnez Vue Projet, puis Ouvrir les données, et importez les fichiers image à analyser dans le logiciel.
Alignez les images en cliquant sur Aligner les tranches et Modifier. Ensuite, dans la barre de menus en bas à gauche, ajustez la valeur de la plage d’intensité en modifiant la transparence de l’image. Sélectionnez le module Extraire le sous-volume, puis cliquez sur les ensembles de données alignés pour ajuster la taille de la partie qui se chevauche de l’ensemble de la pile.
Ensuite, dans la sous-section Segmentation, sélectionnez Rééchantillonner, puis Segmentation, puis cliquez sur Enregistrer. Ensuite, choisissez le seuil de la baguette magique et la taille de l’outil Pinceau pour sélectionner la plage appropriée. Dans le menu Sélection, cliquez sur l’icône Ajouter pour ajouter la zone sélectionnée.
Une fois la segmentation régionale terminée, générez un fichier image en suivant les meilleurs résultats pour la taille de l’objet et la résolution de l’image. Cliquez sur Crop Editor, et dans la boîte de curseur virtuel, entrez le nombre six. Ensuite, dans le menu déroulant de gauche, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la zone grise sous la sous-section Projet et sélectionnez Générer une surface, puis Créer et appliquer.
Dans le fichier généré, à l’aide du module Surface View, créez la structure de surface et la représentation 3D. Les images FESEM 2D révèlent que dans le groupe témoin, les mitochondries étaient réparties uniformément avec des structures de cristae régulières. En revanche, le groupe RSL3 a montré des mitochondries rétrécies avec une densité membranaire accrue et des structures cristae vagues.
Cependant, toutes les cristae mitochondriales n’ont pas dégénéré dans le groupe RSL3 car certaines sont restées intactes. Par rapport au groupe RSL3, le groupe inhibiteur avait pour la plupart des structures cristae intactes avec seulement quelques-unes non apparentes. Les images 3D du groupe témoin ont fourni une vue plus précise des mitochondries et de leurs structures cristae.
Les images 3D du groupe RSL3 ont montré des mitochondries irrégulières et vacuolisées, tandis que le groupe inhibiteur a montré diverses formes de cristae. La quantification des altérations mitochondriales a montré que le groupe RSL3 avait significativement diminué la longueur et le volume mitochondriaux, par rapport au groupe témoin, tandis que le groupe inhibiteur a montré des résultats intermédiaires. RSL3 a également causé un dysfonctionnement mitochondrial et une altération du métabolisme cellulaire en modifiant la morphologie mitochondriale et en déclenchant la ferroptose.
