Commencez par préparer des solutions mères de tous les anticorps à raison de 2 000 microgrammes par millilitre. Ensuite, pour chaque anticorps, étiquetez les tubes de dilution avec leurs concentrations respectives, y compris le nom de l’anticorps. Incluez également un tube vierge pour chaque anticorps en tant que contrôle PBS-TBN du véhicule uniquement.
Ensuite, ajoutez 75 microlitres de PBS-TBN à tous les tubes de dilution d’anticorps étiquetés comme étant de 500 microgrammes par millilitre et moins, y compris les tubes de contrôle du véhicule uniquement. Pour chaque anticorps, pipeter 150 microlitres de la solution mère dans le tube étiqueté 1 000 microgrammes par millilitre. Pour créer une série de dilution complète pour chaque anticorps, transférez 75 microlitres du tube de 1 000 microgrammes par millilitre à la dilution inférieure suivante de la série.
Ensuite, fermez le tube de dilution nouvellement terminé et faites-le brièvement vortex. Ensuite, ajoutez 25 microlitres d’anticorps dilués dans les puits désignés d’une plaque de microtitration à 96 puits, puis ajoutez 25 microlitres de PDL1 humaine recombinante biotinylée à chaque puits de réaction. Couvrir la plaque de microtitration d’une feuille d’aluminium ou d’un joint adhésif en plastique et incuber à température ambiante pendant une heure en agitant sur une plaque vibrante orbitale à 600 tr/min.
Ensuite, diluez les billes humaines recombinantes couplées à PD1 à une concentration de 50 000 billes par millilitre avec PBS-TBN. Retirez la plaque de réaction de microtitration à 96 puits de l’agitateur et décollez le joint de la plaque adhésive. Ajouter 50 microlitres du mélange de billes couplées PD1 humaines recombinantes dans chaque puits.
Fermez hermétiquement la plaque et incubez-la pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante sur un agitateur orbital réglé à 600 tr/min. Après l’incubation, retirez soigneusement le joint de la plaque adhésive. Placez ensuite la plaque sur le séparateur à plaques magnétiques pendant deux minutes pour immobiliser les billes.
Vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont correctement connectés. Retournez l’assiette et jetez le surnageant soigneusement. Pour éliminer l’excès de réactifs de réaction des billes, retirez la plaque de microtitration du séparateur à plaques magnétiques et ajoutez 150 microlitres de PBS-TBN dans chaque puits.
Après avoir retiré le scellant et immobilisé les billes comme démontré, vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont fixés et videz le surnageant. Ajoutez maintenant 100 microlitres de solution de travail SAPE dans chaque puits de réaction et remettez les billes en suspension par pipetage. Fermez l’assiette et incubez-la pendant une heure à température ambiante dans l’obscurité.
Retirez ensuite délicatement la scelleuse de plaque adhésive une fois que les billes sont immobilisées ainsi que l’aimant et la plaque sont fixés ensemble. Videz délicatement le surnageant en retournant la plaque. Pour éliminer l’excédent de SAPE des billes, retirez la plaque de microtitration du support de plaque magnétique et ajoutez 150 microlitres de PBS-TBN dans chaque puits pour remettre les billes en suspension.
Immobilisez ensuite les billes en plaçant la plaque de microtitration sur un séparateur à plaques magnétiques pendant deux minutes. Après avoir vérifié que l’aimant et la plaque de microtitration sont fixés, inversez la plaque et retirez le surnageant. Ensuite, ajoutez 100 microlitres d’immunoglobuline G conjuguée anti-humaine ou anti-lapin Brilliant Violet 421 diluée dans leurs puits respectifs.
Fermez l’assiette et incubez-la pendant une heure dans l’obscurité à température ambiante. Immobilisez ensuite les billes et retirez la plaque adhésive. Confirmez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien fixés et videz le surnageant.
Lavez l’excès d’anticorps secondaires des billes en ajoutant 150 microlitres de PBS-TBN dans chaque puits pour remettre les billes en suspension. Ensuite, placez la plaque de microtitration sur le séparateur à plaques magnétiques pendant deux minutes pour immobiliser les billes. Vérifiez que l’aimant et la plaque de microtitration sont bien ensemble, puis inversez la plaque et videz le surnageant.
Une fois le quatrième et dernier tampon de lavage retiré, retirez la plaque de microtitration du séparateur à plaques magnétiques. À l’aide d’une pipette, remettre les billes en suspension dans 100 microlitres de PBS-TBN par puits. Enfin, pour déterminer l’intensité fluorescente médiane de chaque réaction, lisez la plaque sur le système d’analyse de flux à double rapporteur avec le volume d’aspiration réglé sur 50 microlitres, le nombre minimum de billes à 100 billes, le réglage du délai d’attente à 40 secondes, la plage de déclenchement à 7 000 à 17 000 et le mode de fonctionnement au double rapporteur.
Les quatre anticorps peptidiques polyclonaux anti-PDL1 ont bloqué l’interaction de PDL1 humaine recombinante avec PD1. Le pourcentage d’inhibition des différents anticorps peptidiques anti-PDL1 variait de 48 % à 74 % à la concentration maximale testée de 1 000 microgrammes par millilitre. L’anticorps monoclonal de contrôle positif, l’atézolizumab, a permis d’obtenir un blocage de 92 % de l’interaction PD1-PDL1 à la concentration maximale testée de quatre microgrammes par millilitre.
L’analyse comparative de la liaison des anticorps candidats induits par le vaccin PDL1 à la PDL1 humaine recombinante a indiqué que les quatre anticorps peptidiques polyclonaux anti-PDL1 se sont liés à la PDL1 humaine recombinante d’une manière dépendante de la concentration. L’anticorps anti-PDL1(130) a montré le signal de liaison RH PDL1 le plus élevé des quatre candidats anticorps induits par PDL1 vax.
