Commencez par préparer un sandwich de gel de page polymérisé. Retirez les pinces et les couches de ruban adhésif en papier, puis retirez lentement le peigne. Rincez abondamment les puits avec de l’eau distillée.
Placez correctement le sandwich de gel dans l’appareil d’électrophorèse verticale. Remplissez les réservoirs supérieur et inférieur avec le tampon TBE. Réchauffez les plaques en effectuant un pré-fonctionnement de l’électrophorèse sur gel pendant au moins 30 minutes à 50 watts.
Pendant ce temps, remettre les échantillons séchés en suspension dans cinq microlitres de tampon de chargement de gel dénaturant. Ensuite, utilisez une petite seringue remplie de tampon TBE pour évacuer l’urée des puits du gel. Maintenant, chargez les échantillons dans les puits propres, en prenant note de l’odeur de chargement.
Faites fonctionner le gel pendant deux heures à 50 watts ou jusqu’à ce que le colorant bleu de bromophénol ait épuisé les 2/3 du gel. Après l’électrophorèse, coupez l’alimentation électrique, retirez soigneusement le sandwich en verre et nettoyez les plaques de verre. Placez le gel dans un imageur de gel pour détecter la fluorescence des bandes oligonucléotidiques marquées par FAM.
Après une, quatre et 15 heures d’incubation, cinq ou 50 micromolaires Bsep 1 ont réagi avec deux échantillons micromolaires de TBA G4, TBA simple brin et TBA double brin. Des témoins ont été chargés pour chaque ensemble d’échantillons. Le substrat G4 TBA n’a montré qu’un seul adduit d’alkylation en raison de la disponibilité de seulement G8 pour l’alkylation et le clivage toronné subséquent.
De multiples adduits et bandes de produits de clivage ont été observés dans les TBA simple et double brin, car toutes les guanines étaient sensibles à la réaction Bsep. La réaction de sondage et le tampon tris ont entraîné une cartographie chimique inefficace en raison de la présence de nucléophiles indésirables, entraînant une réduction de la proprioactivité. Les échantillons G4 TBA n’ont montré que la formation d’adduits sans clivage toronné.
Pour les TBA simple et double brin, seule une incubation de 24 heures a conduit à une fragmentation de l’ADN, comparable à la fragmentation de 15 heures sans Tris.
