Pour enrober la plaque d’EME, diluer EME 1 à 20 dans du DMEM avancé froid + Pour l’enrobage de collagène, diluer cinq milligrammes par millilitre de collagène I dans DMEM avancé + à 100 microgrammes par millilitre. Enduisez la plaque de 200 microlitres d’EME ou de collagène dilué pour couvrir entièrement la surface du puits et incubez pendant une à deux heures à 37 degrés Celsius. Pour générer des monocouches, aspirez le milieu à partir d’une plaque de 35 millimètres contenant des organoïdes.
Ajoutez un millilitre de PBS et perturbez l’EME dans les puits avec une pointe P1000, en pipetant de haut en bas environ 20 fois pour desserrer tout l’EME. Transférez le contenu dans un tube conique de 15 millilitres. Ajoutez un millilitre de PBS dans la plaque pour recueillir des organoïdes supplémentaires et transférez-les dans le même tube conique.
Centrifuger l’échantillon à 350 g pendant deux minutes et éliminer le surnageant, y compris tout résidu d’EME. Ensuite, ajoutez un millilitre de solution de trypsine à la pastille organoïde et incubez à 37 degrés Celsius pendant deux minutes. Pipeter 10 fois de haut en bas à l’aide d’un embout P1000 et ajouter deux millilitres d’Advanced DMEM+ pour neutraliser la trypsine.
Centrifuger à 350 G pendant cinq minutes et aspirer le supernant avant de remettre la pastille en suspension dans 4,8 millilitres de rIOM2D. Éliminez l’excès d’EME ou de collagène dans Advanced DMEM+ des puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’organoïdes dans rIOM2D et 10 micromolaires Y27632 dans chaque puits pré-enrobé.
Après 4 à 16 heures, collectez le milieu et centrifugez à 1 000 G pendant une minute. Transférez le surnageant dans un nouveau tube conique de 15 millilitres et jetez la pastille. Lavez chaque puits avec 300 microlitres de PBS avant d’ajouter 200 microlitres de rIOM2D centrifugé dans chaque puits.
Changez le rIOM2D tous les deux à trois jours, en suspendant l’utilisation des monocouches Y27632.2D plaquées sur l’EME facilement reformé en petits sphéroïdes lorsque l’EME a été rajouté au sommet des cellules. En revanche, un substrat de collagène I était insuffisant pour reformer les structures 3D.
