Commencez par préparer tous les réactifs avant l’expérience et décongelez la matrice de la membrane basale sur la glace. Préparez ensuite le milieu monocouche murin. Diluez la membrane basale décongelée de un à 20 avec le milieu monocouche murin froid et maintenez-la sur de la glace.
Placer un insert de culture cellulaire transparent de 0,4 micromètre, à l’aide d’une pince stérile, dans un seul puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Prenez une broche d’angle de l’insert et transférez-la dans le puits. Répétez l’opération jusqu’à ce que le nombre approprié d’inserts de culture cellulaire soit disponible pour la culture.
Pour couvrir la surface apicale de chaque insert de culture cellulaire avec une matrice membranaire basale diluée, placez l’extrémité de la pipette P 200 au centre de l’insert et expulsez la matrice de 150 microlitres. Ensuite, transférez la plaque dans un incubateur stérile à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone, pendant au moins une heure. À la fin de l’incubation, faites pivoter la plaque de 24 puits à un angle de 45 degrés.
Placez un seul doigt sur le coin de la broche pour stabiliser l’insert. Placez délicatement l’embout de la pipette P 200 le long de la face inférieure de l’insert et retirez la matrice de sous-sol. Éliminez tout résidu en excès en lavant chaque insert de culture cellulaire avec 150 microlitres de DPBS stérile sans ions calcium ou magnésium et laissez-les sécher dans une enceinte de sécurité biologique pendant au moins 10 minutes.
Une fois les inserts séchés, ajoutez 400 microlitres de milieu monocouche murin vers le bas et 75 microlitres sur le dessus de l’insert de culture cellulaire. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les inserts de culture cellulaire soient immergés. Laissez l’assiette dans l’enceinte de sécurité biologique ou l’incubateur jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
Ensuite, retirez la plaque de 24 puits de colonoïdes intestinaux matures de l’incubateur et placez-la sous l’armoire de sécurité biologique. Aspirer le milieu à l’aide d’embouts stériles et laver bien chaque avec un millilitre de DPBS stérile à température ambiante. À l’aide d’embouts stériles, retirez le DPBS sans ions calcium ou magnésium.
Digérer chaque bouchon de la matrice membranaire basale en ajoutant 500 microlitres de réactif de dissociation enzymatique dans chaque puits à passer. Pour briser le bouchon, faites pivoter la plaque de 24 puits à un angle de 45 degrés. Placez l’extrémité de la pipette sur le bord du bouchon et délogez-la doucement en pipetant chaque bouchon environ six à 10 fois.
Replacez la plaque de 24 puits dans un incubateur stérile à 37 degrés avec 5% de dioxyde de carbone, pendant trois à quatre minutes. Après l’incubation, pipeter la trypsine de haut en bas cinq à sept fois pour chaque puits sous une enceinte de sécurité biologique. Transférer les colonoïdes dissociés de chaque puits dans un tube conique stérile de 15 millilitres et porter jusqu’à un volume de 10 millilitres avec un produit de lavage de souris glacé.
Ensuite, centrifugez les colonoïdes partiellement digérés à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse à godet oscillant. Sous l’enceinte de sécurité biologique, retirer le surnageant de la pastille à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Retirez également tout milieu restant à l’aide d’une pipette P 200.
Ensuite, re-suspendez la pastille de colonoïde en ajoutant 75 microlitres de milieu monocouche murin. Distribuer 75 microlitres de la suspension colonoïde au centre de chaque insert de culture cellulaire. Pipeter doucement la suspension une ou deux fois avant de l’ajouter au puits pour assurer un placage uniforme.
Placez la plaque de 24 puits avec des inserts de culture cellulaire sur une plate-forme rotative pendant 10 minutes pour permettre une dispersion uniforme à travers l’insert de culture cellulaire, avant de placer la plaque dans un incubateur stérile à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5%. À la fin de l’incubation, déloger les fragments de colonoïdes non attachés en plaçant l’extrémité à côté de l’intérieur de la culture cellulaire et en pipetant le milieu trois à cinq fois avec une pipette P 200. Évitez de perturber les cellules intestinales attachées.
Retirer immédiatement le mélange médium et colonoïde. Répétez l’opération jusqu’à ce que tous les inserts de culture cellulaire aient été nettoyés. Ajoutez maintenant 150 microlitres de milieu monocouche murin préchauffé sur la face apicale de chaque insert de culture cellulaire.
Ajouter 400 microlitres de milieu monocouche murin chauffé à chaque puits d’une nouvelle plaque de 24 puits. Transférer l’insert de culture cellulaire sur la nouvelle plaque en saisissant sa broche à l’aide d’une pince stérile. Changez le milieu tous les deux jours jusqu’à ce que la confluence souhaitée soit atteinte.
Les colonoïdes perturbés enzymatiquement plaqués sur les inserts de culture cellulaire sont initialement apparus dans des amas cellulaires allant de 15 à 150 cellules. Le troisième jour, les cellules se sont aplaties et ont lentement recouvert l’insert de culture cellulaire, atteignant généralement la confluence. Au cours des deux jours suivants, les monocouches ont continué à croître et ont formé une barrière continue qui peut être mesurée quantitativement.
