Commencez par placer les articulations disséquées du genou de la souris dans un plat de culture. Aspirer le milieu de culture et ajouter un milieu de culture frais. Répétez le lavage trois ou quatre fois.
Ensuite, sous un stéréomicroscope, disloquez toutes les articulations dans le milieu de culture en les tirant à l’aide d’une pince à épiler à pointe fine. Enlevez le tibia et autant de vaisseaux, de tendons et de ligaments que possible, en prenant soin de ne pas casser les os. Préparez deux tubes de 15 millilitres par échantillon.
À l’aide d’une pince à épiler, transférer les os disloqués avec les tissus mous dans le premier tube. Pour chaque échantillon obtenu à partir des deux pattes postérieures, ajoutez quatre millilitres de milieu de digestion dans le tube. Pour recueillir les cellules résiduelles et les fragments de tissus, transférer le milieu de culture de la boîte de dissection au deuxième tube de 15 millilitres.
Centrifuger le milieu à 500 G pendant 5 minutes à température ambiante. Après avoir retiré le surnageant, remettre en suspension la pastille avec un millilitre de milieu de digestion. Et transférez cette solution dans le premier tube de 15 millilitres afin qu’elle contienne presque tout le tissu, au total cinq millilitres de milieu de digestion.
Digérer ensuite l’échantillon pendant 60 à 120 minutes à 37 degrés Celsius en agitant dans un four d’hybridation. Après l’incubation, mélanger l’échantillon par pipetage et filtrer la solution cellulaire à travers une crépine cellulaire de 40 microns dans un tube de 50 millilitres. Ajouter 10 millilitres de milieu de culture dans le tube à travers la crépine cellulaire.
Centrifuger à 300 G pendant 5 minutes à température ambiante. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 10 millilitres de milieu de culture. Répétez la centrifugation, jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension avec deux millilitres de milieu de culture.
