Avant de commencer, effectuez l’isolement synovial des fibroblastes et utilisez les cellules non adhérentes recueillies dans le plat enrobé de collagène dans cette procédure. Ensemencez les cellules non adhérentes sur des boîtes de 40 à 60 millimètres qui n’ont pas été enrobées de collagène. Culture des cellules en vrac pendant une journée à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5% de dioxyde de carbone.
Pour éliminer les lymphocytes non adhérents, aspirez le milieu de culture, puis ajoutez un milieu de culture frais. Culture des cellules adhérentes en vrac pendant une à deux semaines avec des changements de milieu tous les deux jours, tout en maintenant la confluence. Ensuite, lavez deux fois avec PBS ou HBSS.
Sélectionner les macrophages synoviaux en traitant avec 0,05% de trypsine dans HBSS et incuber pendant trois minutes à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5% de dioxyde de carbone. Ajoutez ensuite doucement le milieu de culture à 0,05% de trypsine dans HBSS. Après cette étape, ne versez pas le milieu directement sur les cellules.
Pour enlever les cellules détachées, aspirez le milieu cultivé, puis ajoutez doucement le milieu de culture frais. Répéter deux ou trois fois et maintenir les cellules sur le plat dans un milieu de culture frais jusqu’à utilisation. Des cellules de type macrophage ont été isolées de souris C57BL/6 femelles âgées de sept à huit semaines et analysées par RT-qPCR.
L’expression de l’ARNm des marqueurs pan-macrophages CD68, EMR1, ITGAM, CSF1R a montré une isolation riche en macrophages du tissu de la synovite. Pour établir la pureté des macrophages, les marqueurs protéiques de surface pour les macrophages et d’autres types de cellules ont été analysés par cytométrie de flux. Plus de 90% des cellules exprimaient les marqueurs macrophages CD45, CD11b et F4/80, tandis que l’expression du marqueur neutrophile Ly6G et du marqueur des lymphocytes T CD3 était inférieure à 1%
